Ваз 2110 панель дребезжит: Шумоизоляция панели ВАЗ 2110

При ближайшем рассмотрении проблема становится более тонкой. Такое смещение проблематично только в том случае, если мы были заинтересованы в восстановлении истинного распределения больших полуосей в нашей выборке, что затруднительно на практике.Большая полуось только статистически связана с прогнозируемым разделением, измеренным в любой данный момент (см., Например, Duquennoy & Mayor 1991; Раздел 5.3; Торрес 1999; Рисунок 3; Брандекер и др. 2006; Приложение). Хотя среднее прогнозируемое разделение находится в пределах порядка единицы от истинной большой полуоси, существует большой разброс.

Таким образом, хотя большая полуось является более значимой величиной для характеристики двоичной системы, мы не пытаемся выполнить статистический поиск.Тем не менее, мы исследуем потенциальное смещение случайного выравнивания для фиксированного диапазона больших полуосей, к которым наблюдения наиболее чувствительны, а именно 3–300 а.е. В связи с диапазоном возможных эксцентриситетов орбиты (например, тепловое распределение, где f ( e ) = 2 e ), в целом мы ожидаем, что сопоставимые количества визуально-двойных систем будут разбросаны из-за этого смещения для незначительный чистый эффект.

5.6.6. Неопределенности звездных моделей

Современные современные модели звездной эволюции имеют тенденцию переоценивать радиусы (а значит, и светимость) молодых маломассивных звезд на 10–25% по сравнению с эмпирическими измерениями (т.е.г., Дэвид и др. 2016). Это источник систематической ошибки при выводе массы звезды из светимости. Поскольку ошибка по-разному действует на звезды разной массы, она также может повлиять на расчеты отношения масс компонентов двойной и, следовательно, на наши кривые физического контраста и оценки неполноты.

Чтобы изучить величину такого смещения, мы рассмотрим случай двойной M-карлика, для которой одна звезда является излучательной (0,5 M _☉ ), а другая полностью конвективной (0.2 M _☉ ). Мы ожидаем, что любое дифференциальное влияние на отношение масс будет наиболее явным для такого спаривания, поскольку масштабное соотношение масса – светимость изменяется через полностью конвективную границу. Для данного фактора завышения светимости звезды, равного 30% для обоих компонентов, смещение по отношению масс составляет всего ∼5%. Поскольку 30% уже является консервативной верхней границей ошибки светимости модели, мы заключаем, что ее влияние на наши кривые физической чувствительности будет незначительным.

5.6.7. Чистый эффект смещений

На рис. 13 сравнивается доля множественности в поле с нашими измерениями YMG в зависимости от первичной массы. Мы разделим диапазон масс, охватываемый объединенной выборкой, на три интервала: 0,2–0,6, 0,6–1,0 и> 1,0 M _☉ . Значения полей для двух бункеров с большей массой предоставлены Raghavan et al. (2010), тогда как самый низкий интервал — это среднее значение из литературы, рассчитанное Duchêne & Kraus (2013). Для YMG ячейка с самой низкой массой состоит преимущественно из звезд MagAO, тогда как ячейка с самой высокой массой состоит почти исключительно из объектов SACY.На мишени SACY также приходится чуть более 60% бункера промежуточной массы. В дополнение к необработанному измеренному значению этот график показывает грубую поправку, представляющую комбинированный эффект обсуждаемых смещений.

Увеличить Уменьшить Сбросить размер изображения

Рис. 13. Сравнение долей множественности как функции первичной массы между полем и массой, измеренной для YMG в этом исследовании. Черные квадраты обозначают точки поля (Duchêne & Kraus 2013).Красные сплошные кружки представляют собой необработанные измерения из нашей объединенной выборки с SACY, а красные пустые кружки — значения поправки после смещения для наших измерений. Значения с поправкой на смещение в ячейках с большей массой хорошо согласуются с полем. Однако бункер с малой массой отличается незначительно.

Загрузить рисунок:

Увеличить Уменьшить Сбросить размер изображения

Рисунок 14. Анализ сопутствующих визуальных двоичных файлов Clio с данными за несколько эпох. Каждый набор из трех графиков отображает анализ цели, имя которой отображается в верхнем левом углу. C10: Chauvin et al. (2010), J12: Janson et al. (2012), E15: Elliott et al. (2015), J17: Janson et al. (2017) и S17: эта работа. Ссылки и эпохи нанесенных на график точек данных перечислены на графике правой панели. Слева: разделение (вверху слева) и позиционный угол (внизу слева) компаньона. Сплошная линия показывает ожидаемый астрометрический трек удаленного фонового объекта в результате правильного и параллаксного движения основного объекта, а незакрашенные символы обозначают ожидаемые измерения для этого фонового объекта.Серые заштрихованные области представляют 1 σ и 2 σ ошибок в фоновых треках, основанных на неопределенностях в собственном движении, расстоянии и астрометрии первой эпохи. Пунктирными линиями показан идеально движущийся след. Настоящий спутник не должен следовать по фоновой дорожке и должен двигаться минимально относительно основного (т. Е. Следовать по пунктирным линиям). Любое движение между эпохами следует адекватно объяснять орбитальным движением. Справа: ΔR.A. и Δdecl. как видно на небе (Δ относится к первичному – вторичному положению).

Загрузить рисунок:

Увеличить Уменьшить Сбросить размер изображения

Рисунок 15. То же, что и на рисунке 14.

Загрузить рисунок:

Увеличить Уменьшить Сбросить размер изображения

Рисунок 16. То же, что и на рисунке 14.

Загрузить рисунок:

В бункере с малой массой мы начинаем с применения поправок на обнаруживаемость (раздел 5.3), что составляет 6% аддитивного повышения. Затем мы умножаем полученную дробь на коэффициент смещения ветвления 0,8 (см. Раздел 5.6.1). Наконец, мы добавляем 4% повышающую коррекцию для смещения выборки. Общее увеличение составляет ∼2%.

В бункере промежуточных масс мы вычисляем поправки на обнаруживаемость для целей Clio и предполагаем идеальную чувствительность в этом диапазоне масс из обзора SACY.В этом массовом режиме смещение Бранча незначительно. Мы добавляем только 2% для смещения выборки, потому что мишени Clio вносят только ~ 40% в этот массовый интервал. Наконец, мы умножаем долю множественности на коэффициент 1,1, предполагая, что вклад в ~ 10% от двойных систем шире, чем наш диапазон обнаружения.

В максимальном интервале масс, который состоит исключительно из целей SACY, мы применяем поправочный коэффициент 1,25 для учета вклада от широких двойных систем, как описано в разделе 5.6.3).

После корректировки коэффициенты множественности в ячейках с более высокими массами хорошо согласуются с коэффициентами поля.Однако частота двойных M-карликов YMG была увеличена поправками на смещение до большей (> 1 σ ), чем частота поля. Тем не менее, поскольку поправки являются относительно грубыми, а расхождения имеют ограниченную значимость, результаты YMG все еще могут быть согласованы с полевыми измерениями.

Диффузия в двухкомпонентных липидных мембранах — флуоресцентная корреляционная спектроскопия и исследование методом моделирования методом Монте-Карло

Biophys J. 2005 Jan; 88 (1): 317–333.

Агнешка Э.Hac

Группа биофизики и термодинамики мембран, ^* Институт биофизической химии Макса Планка, Геттинген, Германия; и ^† Институт Нильса Бора, Копенгагенский университет, Копенгаген, Дания

Хайко М. Зигер

Группа биофизики и термодинамики мембран, ^* Институт биофизической химии Макса Планка, Геттинген, Германия; и ^† Институт Нильса Бора, Университет Копенгагена, Копенгаген, Дания

Маттиас Фидорра

Группа биофизики и термодинамики мембран, ^* Институт биофизической химии Макса Планка, Геттинген, Германия; и ^† Институт Нильса Бора, Университет Копенгагена, Копенгаген, Дания

Томас Хаймбург

Группа биофизики и термодинамики мембран, ^* Институт биофизической химии Макса Планка, Геттинген, Германия; и ^† Институт Нильса Бора, Копенгагенский университет, Копенгаген, Дания

Группа биофизики и термодинамики мембран, ^* Институт биофизической химии Макса Планка, Геттинген, Германия; и ^† Институт Нильса Бора, Копенгагенский университет, Копенгаген, Дания

Получено 28 января 2004 г .; Принята к печати 19 октября 2004 г.

Abstract

Используя флуоресцентную корреляционную спектроскопию, калориметрию и моделирование методом Монте-Карло, мы исследовали диффузионные процессы в двухкомпонентных мембранах, близких к переходу цепное плавление. Цель состоит в том, чтобы описать сложное диффузионное поведение в липидных системах, в которых сосуществуют гелевые и жидкие домены. Процессы диффузии в гелевых мембранах значительно медленнее, чем в жидких мембранах. Поэтому ожидается, что процессы диффузии в областях смешанной фазы будут сложными.Из-за статистических флуктуаций структура домена гель-жидкость неоднородна в пространстве и времени. Модели таких диффузионных процессов отсутствуют. В этой статье, которая является как экспериментальной, так и теоретической, мы исследовали диффузию в липидных смесях DMPC-DSPC в зависимости от температуры и состава. Затем мы смоделировали эксперимент по флуоресцентной корреляционной спектроскопии, используя моделирование методом Монте-Карло для анализа процесса диффузии. Показано, что моделирование очень хорошо описывает экспериментальные диффузионные процессы и что предсказанные профили автокорреляции накладываются на экспериментальные кривые.Мы считаем, что это исследование дополняет дискуссию о физической природе плотов, обнаруженных в биомембранах.

ВВЕДЕНИЕ

Недавнее открытие нано- и мезомасштабных доменов в биологических мембранах сильно повысило интерес к физическим факторам, которые определяют организацию мембран. В течение последних трех десятилетий общее понимание биологических мембран было основано на модели жидкой мозаики Сингера и Николсона (1972), которая рассматривала липидную мембрану как гомогенную жидкость, содержащую белки, растворенные в липидной матрице.Специфические взаимодействия между отдельными молекулами не рассматриваются. Таким образом, модель Зингера-Николсона неявно предполагает отсутствие латеральных неоднородностей в плоскости мембраны. Однако при анализе фазовых диаграмм липидных смесей необходимо сделать вывод, что разделение фаз обычно ожидается в зависимости от температуры и состава (например, Lee, 1977). Тем более этого можно ожидать в таких сложных многокомпонентных смесях, как биологическая мембрана. Модель матраса Mouritsen и Bloom (1984) предложила взаимодействия, в которых преобладает гидрофобное соответствие соседних компонентов мембраны.Возможность агрегации белков и образования доменов является естественным следствием этой концепции. Эта точка зрения была подтверждена в различных теоретических (Sperotto et al., 1989; Mouritsen and Jørgensen, 1995; Heimburg and Biltonen, 1996; Mouritsen, 1998) и экспериментальных исследованиях модельных систем (Korlach et al., 1999; Bagatolli and Gratton, 1999, 2000b; Nielsen et al., 2000a, b; Feigenson, Buboltz, 2001; Иванова и др., 2003). С момента обнаружения рафтов (наноскопических доменов, богатых холестерином и сфинголипидами) в биологических мембранах интерес к доменам как предполагаемым регулирующим объектам в передаче сигнала возрос (Simons and Ikonen, 1997; Brown and London, 1998; Harder et al., 1998; Ритвельд и Саймонс, 1998; Bagnat et al., 2000; Саймонс и Тоомре, 2000; Едидин, 2003). Это особенно относится к пониманию путей распространения. Если предположить бинарную реакцию между двумя белками в мембранах, которые проявляют различную смешиваемость в разных доменах, скорость реакции вполне может контролироваться латеральной организацией мембраны. Это дает начало общему механизму физического контроля, который не требует конформационных изменений индивидуальных белков.Процессы такого рода очень мало изучены, хотя между тем есть ряд наблюдений, подтверждающих эту точку зрения. Синаптическое слияние, например, ингибируется, когда холестерин удаляется из пресинаптической мембраны и образование рафтов затрудняется (Lang et al., 2001). Таким образом, появляется все больше доказательств биологической значимости процессов образования доменов. Формирование доменов уже давно теоретически предсказывается симуляциями Монте-Карло, особенно группой Муритсена в Дании (e.g., Mouritsen and Jørgensen, 1995 и ссылки в нем), но также и другими авторами (Sugar et al., 1994; Heimburg and Biltonen, 1996). Такие модели в основном основаны на расчетах решеток с 2–10 различными состояниями липидов. Как уже упоминалось, важным параметром в таком моделировании является взаимодействие ближайших соседей, которое частично обусловлено гидрофобным эффектом. Эти взаимодействия влияют на кооперативность переходов, а также на размеры и формы доменов.

Статья посвящена исследованию диффузионных процессов в мембранах, содержащих домены.Существуют различные методы, которые оказались успешными в исследовании процессов диффузии в организованных мембранах: восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания, то есть FRAP (Vaz et al., 1989, 1990; Vaz and Almeida, 1991; Almeida et al., 1992a; Almeida and Vaz , 1995), флуоресцентной корреляционной спектроскопии, т.е. FCS (Eigen and Rigler, 1994; Korlach et al., 1999; Schwille et al., 1999a, b; Pramanik et al., 2000; Feigenson and Buboltz, 2001; Böckmann et al. ., 2003), и отслеживание отдельных частиц (Schmidt et al., 1995, 1996; Schütz et al., 1997; Sonnleitner et al., 1999; Harms et al., 1999, 2001). Эти методы использовались как на моделях, так и на биологических мембранах. Другими методами являются ядерный магнитный резонанс (Fisher, 1978; Kuo and Wade, 1999; Oradd et al., 2002), а также рассеяние нейтронов (Tabony and Perly, 1990; König et al., 1992, 1995). Каждый из этих методов имеет типичные преимущества и недостатки, в частности, в отношении присущих им временных масштабов. При изучении диффузии в липидных мембранах методы конфокальной микроскопии (FRAP, FCS) чувствительны в масштабе времени от миллисекунды до секунды, который представляет собой временной режим, в котором флуоресцентные метки внутри мембран должны диффундировать через фокус диаметром ~ 500 нм. .Типичное значение константы диффузии жидких липидов составляет D = 4 × 10 ^-8 см ² в секунду. С другой стороны, рассеяние нейтронов чувствительно в пикосекундном масштабе времени, который является временным режимом процесса рассеяния ( D = 1 × 10 ⁻⁷ — 4 × 10 ⁻⁶ см ² в секунду для липидов жидкой фазы). Трансляция на один диаметр липида слишком медленная, чтобы ее можно было отслеживать по рассеянию нейтронов (Böckmann et al., 2003). Поэтому считается, что динамическая информация от этого метода отражает ограниченное движение в пределах потенциала, определяемого соседними липидами (Vaz and Almeida, 1991).

Существует также ряд моделей диффузии в липидных мембранах. В однокомпонентных мембранах он был смоделирован с использованием теории гидродинамики Саффмана и Дельбрюка (1975) или моделей свободного объема (Галла и др., 1979). М. Saxton исследовал различные модели диффузии компонентов мембраны (обзоры см. В Saxton and Jacobson, 1997 и Saxton, 1999). Они основаны на различных предположениях относительно геометрии препятствий (Saxton, 1987, 1990, 1994). Это включает возможность существования липидных бислоев с сосуществующими доменами геля и жидкости (Saxton, 1993a).Эти исследования очень помогают почувствовать влияние сложных объектов на диффузию в двух измерениях. В сложных средах часто наблюдается аномальная диффузия, означающая, что среднеквадратичное смещение отклоняется от (фактически, аномальная диффузия определяется как; Saxton and Jacobson, 1997) с постоянной диффузии D . Однако ни одна из этих моделей не использует термодинамическую информацию о системе (хотя экспериментальные исследования FRAP Алмейды и Ваза нацелены на это).Для липидных систем известно, что образование домена зависит от температуры и концентрации (Sugar et al., 1999, 2001). Константа диффузии в жидкой липидной фазе находится в диапазоне 4 × 10 ^-8 см ² в секунду (Blume, 1993; Korlach et al., 1999), тогда как в гелевой фазе она намного медленнее 10 ⁻¹⁶ –10 ⁻⁹ см ² в секунду (в последнем случае значения существенно различаются в литературе). Частично это может быть связано с диффузией по линейным дефектам в фазе пульсации (Schneider et al., 1983). Можно рассматривать гелевые домены как препятствия в жидкой среде. Временные рамки диффузии зависят от того, просачиваются ли домены геля. В этом случае восстановление флуоресценции в эксперименте FRAP может быть неполным. С другой стороны, размер и форма доменов зависят от времени, и поэтому размеры препятствий подвержены колебаниям (van Osdol et al., 1989, 1991; Grabitz et al., 2002). По этой причине типичный временной масштаб флуктуаций, вероятно, влияет на поведение диффузии.Даже в системах с проникающими препятствиями колебания в конечном итоге должны привести к полному восстановлению флуоресценции. Насколько нам известно, модели для таких проблем диффузии не существует. Только Polson et al. (2001) применили модель Монте-Карло к холестеринсодержащим мембранам, основанную исключительно на первых принципах и термодинамических знаниях, к фазовой диаграмме, направленной в направлении представленного здесь исследования.

В этой статье мы исследуем процессы диффузии в бинарных липидных смесях (DMPC / DSPC) с использованием флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS) на поддерживаемых мультислоях и моделирования методом Монте-Карло на основе калориметрической информации, а также типичных постоянных времени из FCS.Было показано, что липидные смеси DMPC и DSPC демонстрируют мезоскопическое и макроскопическое разделение фаз как с помощью конфокальной микроскопии, так и с помощью моделирования (Sugar et al., 1999, 2001; Bagatolli and Gratton, 2000a). Мы используем модель Sugar et al. (1999) в качестве основы для моделирования диффузионного процесса. Цель состоит в том, чтобы понять движение липидов на основе динамической модели, которая полностью использует термодинамическую информацию системы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Липиды были приобретены у Avanti Polar Lipids (Бирмингем, штат Алабама), флуоресцентные метки у Molecular Probes (Лейден, Нидерланды).Ориентированные многослойные мембраны из смесей DMPC / DSPC были созданы сушкой липида на кварцевом покровном стекле из раствора дихлорметан / метанол в высоковакуумном эксикаторе. Затем сухие образцы гидратировали дистиллированной водой и уравновешивали не менее 1 часа. Дистиллированная вода использовалась, чтобы избежать возможных флуоресцентных примесей, вносимых буферными молекулами. Было определено, что pH образца на покровном стекле составляет от 5 до 6, что далеко от значений pK головных групп фосфатидилхолина (ниже 2 и выше 10 для фосфатной и холиновой групп соответственно).Впоследствии диффузионные процессы в мембранах были исследованы с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). В нашей установке инвертированного микроскопа мы использовали линейно поляризованный лазер непрерывного действия 532 нм Nd: Yag (Laser 2000, Wessling, Германия) мощностью 5 мВт. Мы использовали водно-иммерсионный объектив 1,20 NA 60 × (UPLAPO; Olympus) и конфокальную установку с размерами точечных отверстий 30–100 мкм м. Увеличение в фокальной плоскости 50 ×. Зонд был установлен на оптическом столе с пьезоэлектрической XYZ-системой нанопозиционирования.Сигнал флуоресценции регистрировался двумя лавинными фотодиодами SPCM-AQR-13 (Laser Components, Olching, Германия), регистрирующими перпендикулярные поляризации. Перпендикулярная поляризация была введена для поляризационных измерений, не связанных с этой статьей. Кривые корреляции, показанные в этой статье, обычно представляют собой кривые взаимной корреляции между этими двумя каналами. Было обнаружено, что они идентичны автокорреляционным кривым обоих каналов в интересующем временном режиме, но во избежание некоторых кратковременных артефактов, связанных с мертвым временем фотодиодов.Мертвое время находится в пределах 50 нс. Следовательно, два фотона, расстояние которых ближе 50 нс, может быть некорректно записано. При взаимной корреляции второй фотон регистрируется другим диодом, и артефакты мертвого времени уменьшаются. В качестве маркеров флуоресценции использовали TRITC-DPPE () и DiI-C18. Мы провели калориметрические исследования плавления чистого липида в присутствии пяти различных маркеров флуоресценции (DiI-C16, DiI-C18, TRITC-DHPE, BODIPY-C16 и DiD-C18). Для большинства экспериментов по автокорреляции использовалась метка DiI-C18, поскольку она показывала наименьшее нарушение профилей плавления липидов из этих пяти меток.Это указывает на лучшую смешиваемость как в гелевой, так и в жидкой липидной фазе (данные не показаны). Временные рамки были откалиброваны с помощью раствора родамина 6G при 296 К с известным коэффициентом диффузии D = 3 · 10 ^-6 см ² в секунду при 22 ° C. Сигнал от двух APD анализировали с помощью карты FLEX5000 / быстрого коррелятора (Correlator.com, Bridgewater, NJ). Схема установки представлена ​​на рис. Чтобы избежать фотообесцвечивания образцов с медленной диффузией метки (например, гелевых мембран), мы использовали оптические фильтры для уменьшения интенсивности возбуждения до 1000 раз.Это привело к относительно высокому шуму в профиле автокорреляции за короткие промежутки времени при измерении мембран, содержащих гелевые домены (наибольшее затухание). Образование Triplett гасили добавлением кислорода в водный буфер (Calvert и Pitts, 1966).

( слева ) Схематический чертеж установки FCS и моделирования. Лазер ( зеленый ) фокусируется на плоских мембранах, которые, как предполагается, содержат домены. Флуоресцентный свет от фокуса (, желтый, ) проецируется на два лавинных фотодиода ( APD ), которые контролируют различные поляризации.В плоскости изображения находится точечное отверстие. ( Центр ) Следы интенсивности флуоресценции одной молекулы родамина 6G в растворе, TRITC в жидкой липидной мембране и TRITC в гелевой липидной мембране. Обратите внимание на разные временные рамки. ( Правый ) Автокорреляция сигналов флуоресценции, показанная на центральной панели. Шкала времени диффузии внутри жидкой мембраны намного быстрее, чем у гелевой мембраны, но примерно на два порядка медленнее, чем свободная диффузия метки в объемном растворителе.Сплошные линии представляют подгонки согласно формуле. 1.

Предполагая гауссово поперечное сечение фокуса, корреляционная функция в плоской системе определяется выражением

(1)

, где N — среднее число, а τ _d — время задержки. меченых липидов в фокусе (Korlach et al., 1999). Термин в скобках используется как нормализованная корреляционная функция, G _норма ( τ ). Все кривые корреляции, показанные в этой статье, являются нормализованными профилями.Подбор экспериментальных автокорреляционных профилей чувствительно зависит от предположения о гауссовой фокусировке (Hess and Webb, 2002), описывающей интенсивность обнаружения как функцию расстояния от центра фокуса. Эта вероятность обнаружения представляет собой свертку профилей возбуждения и свойств точечных отверстий (Rigler et al., 1993). В наших экспериментах автокорреляционные профили чистых липидных фаз хорошо описывались автокорреляционной функцией в формуле. 1, что указывает на то, что профиль фокуса близок к гауссову.Этот факт используется в дальнейшем при моделировании профилей автокорреляции. Температурный контроль достигался за счет водяного охлаждения объектива и кюветы с образцом. Во время эксперимента (2–5 мин) водяное охлаждение отключалось во избежание механических колебаний. Температура измерялась ультратонкой термопарой непосредственно на покровном стекле.

Калориметрию проводили с использованием высокочувствительного дифференциального VP-калориметра (MicroCal, Northampton, MA) со скоростью сканирования 5 ° / ч.

Для приготовления липидных полусфер (LHS) из смесей DLPC-DPPC для конфокальной микроскопии мы использовали метод гальванопластики (Angelova et al., 1992). Два микролитра исходного липидного раствора наносили на проводящую сторону покровного стекла, покрытого слоем оксида индия и олова (ITO), и упаривали в токе азота. Покрытые покровные стекла были приобретены у PGO (Изерлон, Германия) и затем подвергнуты шлифовке от 1 мм до 0,175 мм в оптической мастерской MPI (Геттинген, Германия). Затем покровное стекло ITO с липидным слоем помещали в эксикатор на ночь для испарения оставшегося растворителя. После этого покровное стекло ITO было помещено в ячейку со вторым проводящим покровным стеклом, отделенным от первого спейсером толщиной 1.5 мм. Пространство между проводящими покровными стеклами заполняли дистиллированной водой. Всю ячейку запечатали вакуумной смазкой, а затем поместили в регулируемую температуру, которая поддерживалась при ~ 60 ° C во время образования LHS. Два покровных стекла соединяли с генератором переменного тока (H-Tronic, Hirschau, Германия), который создавал в конденсаторе поле переменного тока с амплитудой 3 В и частотой 10 Гц, которое применяли в течение 30 мин. После этой процедуры LHS были готовы к экспериментам в конфокальном микроскопе (Leica, Гейдельберг, Германия) и непосредственно наблюдались в ячейке, в которой они были произведены.В конфокальной микроскопии использовались метки DiI-C18 и BODIPY-C16. На этих этикетках указаны предпочтения для гелевой и жидкой фаз смесей DLPC-DPPC соответственно.

Моделирование методом Монте-Карло проводилось на различных настольных компьютерах и рабочих станциях с использованием самописных процедур в C . Мы использовали генератор псевдослучайных чисел ran2 в соответствии с рекомендациями Press et al. (1997) с периодичностью 2 · 10 ¹⁸ . При каждой симуляции мы заново инициализировали генератор случайных чисел с компьютерным временем.

ТЕОРИЯ

Моделирование Монте-Карло

Рассмотрим двухкомпонентную липидную мембрану с липидными цепями, расположенными на треугольной решетке. Две цепи липида ковалентно связаны и занимают два соседних участка треугольной решетки, что позволяет иметь три различных ориентации. Каждая липидная цепь может существовать в двух состояниях: геле или жидкости. Эти два состояния различаются внутренней энергией и энтропией. Гамильтониан такой системы определяется выражением

(2)

, где и — количество гелевых и жидких липидных цепей липидных видов A, и B , а и — соответствующие внутренние энергии двух состояний. видов A или B .Это количество взаимодействий между липидом вида i в состоянии α с липидом вида j в состоянии β , а — соответствующие энергии взаимодействия. Ранее было показано, что на этой основе свободная энергия Гиббса для данной микроконфигурации может быть записана как (Sugar et al., 1999)

(3)

, где Δ H _A и Δ H _B — калориметрические энтальпии плавления, и Δ S _A = Δ H _A / T _{m, A} и Δ S _B H = 906 / T _{m, B} — соответствующие энтропии плавления двух отдельных липидов, при этом T _{m, A} и T _{m, B} — температуры плавления двух чистых компонентов. G ₀ — это свободная энергия Гиббса для гелевой матрицы без каких-либо взаимодействий между непохожими ближайшими соседями. Для нашего моделирования нам не обязательно знать этот параметр, поскольку нас интересуют только разности свободной энергии. Параметры взаимодействия ближайших соседей липидной цепи видов i в состоянии α с липидной цепью видов j в состоянии β (являются простыми функциями; см. Sugar et al., 1999 ). Параметры кооперативности и определяют полуширину перехода отдельных профилей плавления липидов (Иванова, Хаймбург, 2001).Таким образом, из 10 параметров шесть можно легко определить из калориметрических экспериментов с одиночными липидными мембранами видов A и B . Остальные четыре параметра,,, и определяют форму фазовой диаграммы (Sugar et al., 1999). Фазовое пространство исследовалось с помощью моделирования методом Монте-Карло, как описано ранее (Sugar et al., 1999; Иванова и Хаймбург, 2001). Для этого необходимо создать липидную конфигурацию компьютерной решетки. Липидным цепям позволяют изменять состояние с использованием алгоритмов Глаубера (Glauber, 1963) и диффундировать в плоскости за счет обмена липидов между ближайшими соседями, как описано в.Здесь мы предположили, что каждая стадия диффузии липидов идет в случайном направлении, что является правильным, если типичные длины корреляции короче молекулярных размеров (Einstein, 1906). Это подтвердилось в недавнем МД-моделировании (Böckmann et al., 2003). Как показано на, были разрешены различные этапы диффузии, которым давалась одинаковая априорная вероятность. Это предположение не имеет твердых теоретических оснований. У нас нет подробных экспериментальных знаний о молекулярной природе стадий диффузии.Вся симуляция основана на двумерной модели Изинга, которая явно неверна в молекулярных масштабах, поскольку она содержит только два состояния липида, что, конечно, нереально. Двумерная модель Изинга имеет свою силу в описании макроскопических флуктуаций (Mouritsen et al., 1983), независимо от молекулярных деталей. Поэтому мы предполагаем, что для вопросов, заданных в этой статье, подробный молекулярный выбор ступени диффузии не важен, если мы смотрим на масштабы длины микроскопического размера фокуса.

( Left ) Состояние меняется от геля к жидкости отдельных липидных цепей в моделировании Монте-Карло. ( Right ) Возможные стадии обмена липидов между ближайшими соседями, ведущие к диффузии. На матрице моделирования липидные цепи расположены на треугольной решетке. Все отдельные этапы обмена исследовались с одинаковой частотой. Связь между двумя цепями липида обозначена полосой.

Моделирование эксперимента FCS

Моделирование Монте-Карло

Далее мы хотим имитировать эксперимент FCS моделированием Монте-Карло, используя типичные постоянные времени из измерений FCS.Моделирование методом Монте-Карло выполняется таким образом, что изменения состояния цепи (гель или жидкость) или смена положения двух липидов осуществляется путем случайного выбора липидной цепи или двух соседних липидов на матрице. Свободная энергия Гиббса решетки вычисляется до и после изменения состояния решетки (см.), А вероятность того, что новое состояние будет принято, вычисляется в соответствии с фактором Больцмана, содержащим разность свободной энергии между двумя состояниями (Sugar et al. др., 1994).Для расчета свойств равновесия не имеет значения, являются ли изменения состояния между двумя последовательными шагами Монте-Карло физически реалистичными или нет. Решение о том, принимать ли новое состояние или нет, принимается исключительно на основе разницы свободной энергии между двумя состояниями. Например, можно обменивать положения липидов, которые не локализованы на соседних участках решетки, хотя этот процесс очень маловероятен в реальной липидной мембране. По этой причине моделирование методом Монте-Карло обычно не содержит информации о временных масштабах.

В этой статье мы исследуем фазовое поведение смесей липидов DMPC и DSPC. Параметры этой смеси были определены Sugar et al. (1999) и немного модифицированы нами на основе подгонки расчетных профилей теплоемкости к профилям дифференциальной калориметрии многослойных везикул. Набор параметров, который обеспечил наилучшее глобальное соответствие профилям плавления (см. справа ) различных смесей DMPC-DSPC, приведен в. ( справа ) также показывает хорошее согласие между экспериментом и моделированием.Для других соотношений смешивания это также хорошо. Далее мы предполагаем, что различия между многослойными и однослойными системами отражаются в профилях плавления и, следовательно, в параметрах моделирования. Однослойные пузырьки обнаруживают менее кооперативное плавление и по этой причине, вероятно, более мелкие домены. Кроме того, мы предполагаем, что возможные различия в масштабах времени диффузии вызваны изменениями в расположении доменов, а не прямым взаимодействием отдельных липидов в разных слоях.Параметры нашего моделирования MC, как упоминалось, были получены для многослойных везикул, которые отражают экспериментальную ситуацию в эксперименте FCS (см. Ниже).

( Left ) Фазовая диаграмма, показывающая нижний и верхний пределы калориметрических событий. Области ожидаемого микроскопического или макроскопического разделения областей геля и жидкости показаны затемненными. ( Справа ) Профиль теплоемкости смеси DMPC: DSPC 50:50 ( сплошная линия ) и соответствующее моделирование Монте-Карло ( символа ).

ТАБЛИЦА 1

Параметры моделирования Монте-Карло

Из касательной конструкции можно определить нижний и верхний пределы профиля плавления и нанести на диаграмму. В ( слева ) показано, насколько хорошо совпадают границы калориметрического эксперимента и моделирования. Эта диаграмма в литературе часто называется фазовой диаграммой (Lee, 1977). Однако следует использовать это выражение с большой осторожностью. Наличие аномалий теплоемкости не обязательно означает макроскопическое фазовое расслоение.Определение фазы, как это было сделано Гиббсом, требует макроскопического разделения фаз, когда свободной энергией границ раздела доменов можно пренебречь. Это явно не относится к смесям, описанным в этой статье. Sugar et al. (2001) обнаружили, что области макроскопического расслоения не совпадают с внешними пределами профиля теплоемкости. В этой статье распределение размеров доменов в зависимости от температуры было количественно определено с использованием модели, также использованной здесь. В ожидаемых областях локального или глобального сосуществования гель-жидкость заштрихованы.

Из моделирования Монте-Карло можно также вывести моментальные снимки Монте-Карло, которые являются графическим представлением конфигурации матрицы в данный момент времени во время моделирования. На четырех снимках показаны четыре различных температуры ниже, внутри и выше режима плавления. Красные области соответствуют липидам в гелеобразном состоянии; зеленые области соответствуют липидам жидкой цепи. Цветовой код такой же, как определен в. Как можно легко увидеть, снимки при T = 302 K и T = 319 K содержат, соответственно, небольшие домены жидкости в матрице геля или небольшие домены геля, встроенные в матрицу жидкости.Эта ситуация не отражает разделения фаз; вместо этого он отражает кооперативные колебания состояния. Однако два других снимка при T, = 305 K и T, = 317 K действительно отражают макроскопическое фазовое разделение, поскольку при 305 K существует одна макроскопическая область жидкости того же масштаба, что и размер матрицы, а при 315 K существует одна макроскопическая область геля в масштабе длины матрицы. Таким образом, одним из критериев определения наличия разделения фаз является то, соответствуют ли размеры доменов размеру матрицы.Для сравнения, в ( справа ) показаны изображения конфокальной микроскопии четырех соседних пузырьков на покровном стекле ITO. Эти изображения были получены из DLPC: смеси DPPC = 30:70 при 306 К. Цветовой код на микроскопических изображениях для этой цели такой же, как и в моделировании Монте-Карло: красные области соответствуют доменам геля, а зеленые области соответствуют жидкие домены. Видно поразительное сходство форм доменов между моделированием и экспериментом, хотя следует отметить, что показанные снимки соответствуют ∼30 × 26 нм, тогда как диаметры пузырьков в ( справа ) составляют ∼15–25 μ м.Здесь мы показываем смесь DLPC-DPPC при комнатной температуре, поскольку контроль температуры в доступных нам конфокальных микроскопах был затруднен. Однако фазовая диаграмма смесей DLPC-DPPC очень похожа на диаграмму DMPC-DSPC. Последняя диаграмма просто сдвинута в сторону более высоких температур. Поэтому мы предполагаем аналогичное поведение. Мы также записали несколько изображений низкого качества везикул DMPC-DSPC при более высоких температурах с держателем образца, подключенным к водяной бане (не показана). Также было обнаружено образование доменов, хотя формы доменов, как правило, были более удлиненными.Подводя итог, однако, моделирование, похоже, отражает формы доменов, обнаруженные в экспериментах.

( слева ) Типичные снимки методом Монте-Карло смеси 50:50 DMPC: DSPC при четырех температурах ниже, внутри и выше режима плавления (см.). Цветовой код показан на рис. ( красных домена соответствуют липидам геля, зеленых домена жидким липидам.) Обратите внимание на различные масштабы длины доменов (макроскопические и микроскопические домены). ( Правый ) Изображение, полученное при конфокальной микроскопии смеси DLPC: DPPC 30:70 при 306 K, демонстрирующее образование доменов (гелевые домены в красном цвете , жидкие домены в зеленом ).Сравните с формами доменов в моделировании.

Шкалы времени диффузии

Очевидная слабость в том, что моделирование методом МК не содержит шкалы времени, также является сильной стороной моделирования методом Монте-Карло, поскольку оно позволяет нам рассчитывать термодинамические свойства систем, которые колеблются в очень медленных временных масштабах. Это невозможно с помощью такого метода, как молекулярная динамика. В этой статье, однако, мы хотим рассчитать временные рамки диффузии липидов, близких к переходам плавления.Для этого нужно найти способы включить реалистичные временные рамки.

В принципе, можно моделировать зависящие от времени процессы с помощью моделирования Монте-Карло, если тщательно выбирать отдельные шаги Монте-Карло. Температурная зависимость релаксационного поведения одиночных липидных мембран в режиме плавления, например, была правильно предсказана автокорреляцией флуктуаций энтальпии во время моделирования MC (Grabitz et al., 2002). Однако для этой цели шкала времени Монте-Карло должна быть переведена в шкалу реального времени с помощью постоянного коэффициента преобразования, который должен быть взят из эксперимента.Фактически, основная идея в знаменитых статьях Эйнштейна о броуновской диффузии (Einstein, 1905, 1906) состоит в том, чтобы связать временные шкалы флуктуаций с реальными временными шкалами по сравнению с экспериментом (путем введения коэффициентов трения). При моделировании MC диффузия должна моделироваться реалистичными шагами трансляции как обмен ближайшими соседями по сравнению с обменом случайных липидов. Как уже упоминалось, последний случай также дает всю термодинамическую информацию, но не дает реальных временных масштабов.

В настоящем исследовании мы намерены моделировать диффузионное поведение липидов в режиме сосуществования гель / жидкость бинарной липидной смеси.Известно, что константа диффузии в гелевой фазе липидов на несколько порядков меньше константы диффузии в жидкой фазе. Это связано с тем, что гелевая мембрана отображает кристаллический порядок липидов в плоскости мембраны, тогда как жидкая мембрана представляет собой случайную двумерную жидкость. Кроме того, временной масштаб колебаний энтальпии связан с теплоемкостью (Grabitz et al., 2002). Таким образом, существует три макроскопических временных шкалы (колебания состояния, диффузия липидов в среде геля и диффузия в жидкой среде), которые должны быть реализованы в моделировании Монте-Карло.Коэффициенты преобразования между масштабами моделирования и эксперимента могут зависеть от микросреды липидов. Это можно ввести в моделирование, приняв решение ввести различные базовые процессы Монте-Карло (изменения состояния, липидный обмен в геле и жидкую фазу) с разной частотой. Если экспериментальная шкала времени диффузии в гелевой фазе на два порядка меньше, чем в жидкой фазе, процедура Монте-Карло, которая определяет трансляцию липидов, вводится в 100 раз реже.Этот механизм все еще подчиняется детальной балансировке.

Для липидов со средой как гелевых, так и жидких липидов, мы сделали вероятность входа в программу трансляции программы в зависимости от доли липидных цепей геля, f _{c, g} , окружающих два липида, которые являются подлежат обмену в процессе обмена между ближайшими соседями (включая также цепи липидов). Эта процедура влияет только на временные шкалы, но не на тепловое равновесие, пока все этапы моделирования подчиняются детальному балансу.Мы ввели функцию скорости r ( f _{c, g} ),

(4)

Скорость r ₀ — это вероятность войти в программу трансляции липидов в жидкой фазе (с f _{c, g} = 0). Δ E соответствует барьеру активации для обмена двух липидов в полностью гелевой среде ( f _{c, g} = 1) и должен быть откалиброван экспериментально. Практически уравнение. 4 определяет микровязкость за счет активированного процесса, который зависит от липидного микроокружения.Если два липида выбраны случайным образом, определяется гелевая фракция в среде этих липидов, и вероятность вступления в процедуру липидного обмена регулируется в соответствии с функцией r ( f _{c, g} ). Это определение необходимо, потому что липиды на границах доменов имеют как гелевую, так и жидкую среду, и поэтому мы предполагаем, что они также демонстрируют промежуточные скорости обмена. Этот подход был выбран потому, что экспериментальные детали физики границ раздела доменов неизвестны.В недавней статье (Иванова и др., 2003) мы утверждали, что упругие постоянные на границах раздела доменов могут быть значительно увеличены, потому что колебания гель-жидкость максимальны. Следовательно, вероятность получить дефекты в липидной матрице, возможно, выше на границах раздела доменов. Если диффузия происходит по механизму дефекта, диффузия по границам доменов может усиливаться. Однако из-за отсутствия экспериментальных данных об этих процессах мы выбрали простое определение констант скорости обмена, описанное в формуле.4. В будущих исследованиях может оказаться, что этот подход слишком упрощен.

В наших экспериментах мы обнаружили, что диффузия в гелевой фазе была в ~ 70 раз медленнее, чем в жидкой фазе (и). Следовательно, мы определили Δ E / kT ≈ 4,25, что соответствует отношению частоты обмена в жидкости ( f _{c, g} = 0) и в гелевой фазе ( f _{c, g} = 1). Доля геля по окружности определяется для каждой пары липидов.Вероятность входа в программу перевода корректируется в соответствии с коэффициентом r . Подводя итог: в моделировании у нас есть три шкалы времени. Один определяется частотой попыток изменить состояние липидной цепи; второй определяется частотой r ₀ , чтобы попытаться переместить липид в жидкую фазу; а третий определяется частотой r ( f _{c, g} = 1) для перемещения липида в гелевую фазу. Три частоты выбираются путем сравнения с экспериментом (см. Ниже).В большинстве представленных здесь симуляций частота r _{состояние} для попытки изменения липидного состояния также была выбрана равной r ₀ . Это произвольно, и эффект изменения этой частоты обсуждается ниже. В принципе, эта информация скрыта в профиле FCS.

Экспериментальные и теоретические автокорреляционные функции трех смесей DMPC / DSPC при разных температурах. ( Left ) Смесь 70:30 при 289,3 К, 303,0 К, 309.2 К и 319,2 К (ниже, в пределах и выше режима плавления; см.). ( Центр ) Смесь 50:50 при 290,5 К, 303,6 К, 309,7 К и 322,5 К (ниже, внутри и выше режима плавления). ( Right ) Смесь 30:70 при 291,0 K, 317,6 K и 330,0 K (ниже, внутри и выше режима плавления). Экспериментальные профили очень хорошо описываются моделированием. Следует отметить, что моделирование основывается исключительно на калориметрических входных параметрах и не требует какой-либо подгонки, за исключением корректировки временных шкал в фазах чистого геля и чистой жидкости.Все промежуточные профили являются скорее прогнозами, чем совпадениями.

Эксперимент FCS в моделировании

В эксперименте FCS флуоресцентные красители диффундируют через фокус лазера и создают сигнал флуоресценции на фотодиодах. Было показано, что профиль детектирования флуоресценции конфокальной установки (зависящий от профиля возбуждения и свойств точечных отверстий) хорошо аппроксимируется гауссовым поперечным сечением (Magde et al., 1972; Rigler et al., 1993). Поскольку мы выполняем FCS на мембране с планарной опорой, нам не нужно беспокоиться о профиле фокуса в направлении z .Мы можем смоделировать эксперимент FCS, случайным образом пометив некоторые липиды в матрице моделирования виртуальным маркером флуоресценции, и мы можем записать смоделированную интенсивность флуоресценции из каждого снимка Монте-Карло (см.). Мы предполагаем, что время жизни флуоресценции метки короче, чем у процесса обмена ближайшими соседями. Предполагая, что константа диффузии в мембране жидкой фазы составляет ∼4 × 10 ⁻⁸ см ² в секунду, средний период времени для перемещения на один диаметр липида (7 Å) составляет ∼30 нс (см. Böckmann et al., 2003), что намного превышает среднее время жизни флуоресцентного красителя ∼4 нс. Таким образом, при моделировании мы предполагаем мгновенное излучение фотонов. Схема моделирования FCS показана на ( слева ). Концентрические кольца в этом моделировании указывают на гауссовский фокус, белые точки имитируют маркеры флуоресценции, которые случайным образом размещены на липидах. Во время моделирования маркеры перемещаются и генерируют сигнал интенсивности флуоресценции в соответствии с их положением в фокусе,

(5)

, где r ₀ — координата центра фокуса.Это в точности имитирует ситуацию в эксперименте. Типичный график интенсивности флуоресценции для жидкой мембраны показан на ( правая верхняя панель ). ( правая нижняя панель ) показывает профиль автокорреляции от смоделированного флуктуирующего сигнала.

( слева ) Эксперимент по корреляции флуоресценции можно смоделировать в моделировании Монте-Карло, пометив некоторые липидные цепи маркером ( белые точки ) и введя фокус с гауссовым поперечным сечением ( концентрических круга ). ).( Верхняя правая панель ) Предполагая мгновенное излучение после возбуждения с гауссовой вероятностью обнаружения, можно получить сигнал флуоресценции от диффундирующих меченых липидов. ( Правая нижняя панель ) Автокоррелированный профиль сигнала на верхней панели.

Более подробно, мы выполнили моделирование FCS таким образом, что на решетке 60 × 60 были случайным образом помечены 200 липидных цепей ( открытых маркера, в, слева, ). Для этого моделирования диаметр фокуса был выбран равным 50 липидным цепям.Ниже обсуждается зависимость моделируемой флуоресценции от фокального радиуса. Случай, когда метили две цепи в одном липиде, был запрещен. При этом мы предположили, что липиды DMPC и DSPC были помечены с равной вероятностью. Поэтому в экспериментах, описанных ниже, мы использовали флуоресцентные маркеры с примерно равным распределением в обеих липидных фазах (как определено калориметрическим методом; см. Материалы и методы).

Само моделирование использовало периодические граничные условия.Это означает, что липид, который диффундирует из левой части блока моделирования, возвращается в блок с правой стороны. Теперь может возникнуть проблема, заключающаяся в том, что диффузия липидов может напоминать диффузию в замкнутом объеме или загоне (Saxton, 1993b), если расстояние от метки до центра фокуса не намного больше диаметра фокуса. Поскольку смоделированный размер фокуса имеет тот же порядок, что и липидная матрица, мы попытались избежать граничных эффектов, отслеживая расстояние каждой метки от центра фокуса, допуская расстояния до 2.5 диаметров симулятора (что в шесть раз больше фокусного радиуса). Это означает, что даже несмотря на то, что метка может распространяться из окна моделирования с левой стороны и повторно входить с правой стороны, мы записали направление ступеней диффузии и вычислили эффективное расстояние от центра фокуса и вычислили обнаруженную интенсивность флуоресценции. соответственно. Для автокорреляции некоторые авторы использовали виртуальные аппаратные корреляторы (Wohland et al., 2001) для корреляции смоделированного сигнала.Здесь мы вместо этого сохранили смоделированный сигнал флуоресценции в файл и выполнили автокорреляцию после моделирования ( G = F [ F ( I ( t )) · F ( I ( t )) *], где F и F * являются преобразованиями Фурье следа интенсивности). Смоделированные автокорреляционные профили чистого геля или жидкой липидной матрицы имеют точно такую ​​же форму, что и экспериментальные профили. Кроме того, смоделированный профиль имеет форму, идентичную простой автокорреляционной функции, описанной в формуле.1. Чтобы проверить, присутствуют ли все еще граничные эффекты, мы выполнили контрольное моделирование, в котором диффузия прослеживалась в 13 раз больше смоделированного радиуса фокуса (фактически, более 330 диаметров липидной цепи). Мы обнаружили, что диффузия могла быть немного недооценена при использовании коробки меньшего размера. Однако это отклонение невелико (<10% постоянной диффузии) и носит систематический характер (то есть одинаково для всех моделей). Поэтому мы предполагаем, что граничные эффекты не имеют значения при интерпретации наших данных, и что наше моделирование правильно имитирует процесс диффузии.

Размер фокуса

Наблюдаемый объем в эксперименте находится в диапазоне 500 нм, в зависимости от размера точечного отверстия (от 30 до 100 мкм м). Принимая диаметр липидной цепи ∼5 Å, это соответствует ∼1000 × 1000 липидных цепей. В этой статье мы использовали меньшие компьютерные решетки в диапазоне от 60 × 60 до ∼200 × 200 липидных цепей. Это соответствует 30–100 нм. Основная причина этого — ограниченное компьютерное время. Обычно мы выполняли моделирование методом Монте-Карло с 2–20 · 10 ⁶ циклами MC.Это необходимо для расчета автокорреляционной функции на несколько порядков с приемлемой точностью. Расчет матрицы 60 × 60 в этом масштабе времени занимает около 12 часов на настольном ПК с частотой 2 ГГц; и вычисления на матрице 200 × 200 используют компьютерное время примерно в одну неделю или дольше, в зависимости от количества шагов Монте-Карло. По этой причине в большинстве случаев мы работали с матрицами меньшего размера. Эффект от использования сечения фокуса моделирования меньше размера экспериментального фокуса обсуждается ниже (см. Результаты ниже).Однако следует отметить, что фокус компьютера и реалистичный размер экспериментального фокуса не так уж далеки друг от друга.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Целью настоящего исследования является сравнение экспериментальных профилей FCS с моделированием, чтобы получить представление о доменной структуре и временных масштабах бинарных липидных смесей.

FCS эксперименты и сравнение с моделированием

Мы провели измерения FCS на многослойных пакетах мембран при данной молярной доле DSPC в DMPC.Используя многослойные мембраны, мы постарались минимизировать возможный эффект взаимодействия покровного стекла с прилегающей мембраной. Поскольку мы знаем концентрацию флуоресцентных меток в липидной мембране, а также размер фокуса, мы можем вывести количество липидных слоев из количества меток в фокусе (см. Уравнение 1). В типичном эксперименте у нас были стопки из 50 бислоев. Температуру всего микроскопа (кювета для образца и линза объектива) контролировали с помощью циркулирующей воды. Таким образом, можно было с хорошей точностью регулировать температуру.Абсолютное значение температуры было получено с помощью крошечной термопары непосредственно на покровном стекле.

показывает профили автокорреляции трех различных смесей DMPC: DSPC при разных температурах. Кривые с самым быстрым и самым медленным временными шкалами на каждой панели соответствуют чистой жидкой и гелевой фазам соответственно. Шкалы времени этих экспериментов были использованы для калибровки шкалы времени диффузии моделирования, определенного формулой. 4. Профили жидкости и геля на трех панелях почти идентичны.Таким образом, шкала времени диффузии в чистой гелевой и жидкой фазах примерно не зависела от соотношения липидов в смеси. Если мы посмотрим на фазовую диаграмму, можно предсказать, что есть области, где сосуществуют домены гелевого и жидкого состояний. Промежуточные профили на трех панелях отражают случаи в этом режиме (см.). Однако ясно видно, что эти профили не состоят из суперпозиции автокорреляционных функций геля и жидкости (см. Также справа , который обсуждается ниже).Сплошные линии соответствуют моделированию методом Монте-Карло, основанному исключительно на термодинамической информации из профилей теплоемкости с использованием уникального набора параметров моделирования (). Единственные числа, которые изменялись при моделировании, — это температура и состав. Теоретические профили дают удивительно хорошее описание экспериментальных профилей. Следует еще раз подчеркнуть, что теоретические профили являются прогнозами и не соответствуют действительности. Информация о шкалах времени получена из сравнения шкалы времени Монте-Карло с экспериментальными шкалами времени для чистых фаз.

( Левый ) Экспериментальные профили автокорреляции подвержены некоторым изменениям из-за изменений положения в образце и из-за небольших колебаний температуры. Здесь для трех различных температур смеси 70:30 DMPC: DSPC показано среднее изменение профилей автокорреляции. Для репрезентативных профилей были выбраны, которые показаны здесь сплошными линиями. Пунктирные линии — это прогнозы моделирования, показанные на. ( Правый ) Эта панель показывает, что профили корреляции из двухфазного режима плохо описываются наложением чистого геля ( правые кривые ) и чистого жидкого компонента ( левые кривые ) со свойствами, идентичными чистая фаза (соотношение двух компонентов было выбрано в соответствии с правилом Рычага).Пунктирные линии представляют собой суперпозицию аналитических профилей согласно формуле. 1. Профили моделирования методом Монте-Карло (которые идентичны эксперименту) показаны сплошными линиями. См. Текст для обсуждения.

Из качества вычислительного предсказания автокорреляционных профилей можно сделать два вывода:

1. Доменные структуры и детали формирования доменов в описании Монте-Карло должны быть близки к реальности. Поэтому может быть разрешено более внимательно изучить моделирование, чтобы узнать подробности областей и фаз (которые не совпадают).

2. Моделирование методом Монте-Карло позволяет получить представление о цепочке событий в реальной мембране и, следовательно, может использоваться для анализа временных масштабов.

Однако сначала необходимо обсудить некоторые детали измерения. Результат диффузионного эксперимента подвержен некоторому рассеянию вокруг среднего профиля (). Скорее всего, это рассеяние связано с разной степенью наложения в многослойном образце, а также может зависеть от изменения температуры конфокальной установки.Кстати, это рассеяние также должно зависеть от теплоемкости образцов, поскольку колебания состояния зависят от теплоемкости. Таким образом, в принципе в идеальном эксперименте можно было бы связать флуктуации автокорреляции с теплоемкостью. Мы рассмотрим это более подробно в будущих исследованиях. В данном случае, однако, неточности в точных условиях выборки являются вероятной причиной изменений в профиле автокорреляции. ( слева ) показывает изменение при трех различных температурах смеси 70:30 DMPC: DSPC.Выбранные профили являются репрезентативными и непредвзятыми. Также в ( слева ) показаны расчетные профили.

Как обсуждалось выше, автокорреляционные профили — это не просто суперпозиции корреляционных функций гелевой и жидкой фаз (, справа ). Если мы построим профиль автокорреляции с помощью суперпозиции, мы получим форму, приведенную в формуле. 6,

(6)

, что явно не описывает экспериментальный профиль. Следует, однако, отметить, что автокорреляция фактически может быть подобрана двухкомпонентной подгонкой формы, представленной в формуле.6, но с типичными временами корреляции, которые отклоняются от τ _{d, гель} и τ _{d, жидкость} (см. Также Korlach et al., 1999). Возможная причина этого может заключаться в том, что в области жидкой фазы всегда есть небольшие области гелевой природы, и наоборот (см.). Таким образом, неудивительно, что измеренные константы диффузии для быстрого компонента в режиме смешанной фазы медленнее, чем для чистой жидкой фазы, и что медленный компонент быстрее, чем для чистой гелевой фазы.

Моделирование, однако, является предсказанием и не соответствует действительности. Хорошее согласие с экспериментальными данными является гораздо более значимым результатом, чем подобранный двухкомпонентный профиль, где точное значение двух компонентов неясно (см. Korlach et al., 1999).

Влияние размера фокуса при моделировании

Большинство моделей, показанных в этой статье, были выполнены на треугольной решетке 60 × 60. Предполагая, что диаметр цепи составляет 5 Å, этот размер коробки соответствует ∼30 нм × 25 нм.Диаметр фокуса в этих расчетах составлял 50 цепочек, соответствующих 25 нм. Это значительно меньше экспериментального диаметра фокуса (в зависимости от пинхолов ∼500 нм ≅ 1000 цепочек). Чтобы исследовать влияние размера окна моделирования, мы выполнили некоторые вычисления на более крупных матрицах моделирования (80 × 80 и 200 × 200). Как видно из ( слева ), увеличение размера матрицы (и одновременное увеличение размера фокуса) оказывает лишь незначительное влияние на профиль автокорреляции. Напротив, небольшие отклонения кажутся следствием несовершенной корреляции из-за ограниченной длины моделирования.Однако размер матрицы 200 × 200 соответствует 100 нм × 83 нм, что почти того же порядка величины, что и экспериментальный размер фокуса. Наши результаты не исключают, что на профиль автокорреляции влияют размерные эффекты. Однако эти различия невелики в диапазоне исследуемых размеров матрицы и фокуса.

( Левый ) Зависимость профиля автокорреляции от увеличения матрицы и размера фокального радиуса: 60 ​​× 60 с фокусным радиусом 25 цепочек, 80 × 80 с фокусным радиусом 38 цепочек и 200 × 200 с фокусным радиусом фокусный радиус 95 цепочек.На профили автокорреляции незначительно влияет размер системы моделирования. Матрица 200 × 200 соответствует 100 нм × 83 нм, что близко к экспериментальному масштабу длины. ( Правый ) Зависимость автокорреляционной функции от шкалы времени релаксации, отражающей частоту попыток изменить состояние цепи и изменить положение в жидком состоянии, обозначенная соотношением 1: 1, 1: 100, 1: 1000 и 1: ∞ (без колебаний состояния). Если изменения состояния менее часты, чем изменения положения, медленные компоненты в профиле автокорреляции более выражены.Это показывает, что профиль автокорреляции содержит информацию о временных масштабах релаксации. Промежуточный фазовый режим при всех скоростях флуктуаций вполне может быть описан аномальной субдиффузией ( красные линии ). Параметры указаны в тексте.

Влияние шкалы времени релаксации флуктуаций состояния липидов

Выше было упомянуто, что экспериментальные профили автокорреляции также могут быть описаны с помощью двухкомпонентной аппроксимации. Однако картина наличия двух разных фаз может вводить в заблуждение.Во время моделирования Монте-Карло ясно видно, что со временем гелевые домены могут превращаться в жидкие и наоборот. Масштаб времени этих взаимных преобразований тесно связан со временами релаксации флуктуаций состояния, которые зависят от теплоемкости (Grabitz et al., 2002). Время релаксации может быть очень долгим. Для многослойных везикул они составляют до 45 с при максимуме теплоемкости. Таким образом, для липидных смесей можно экстраполировать, что время релаксации в режиме смешанной фазы все еще порядка 0.01–10 с. Это сопоставимая шкала времени с тем, что липиду в гелевой или жидкой среде необходимо для диффузии через фокус микроскопа. Это означает, что в течение времени, в течение которого липид находится в фокусе, его состояние (и, следовательно, его диффузионные свойства) могут изменяться. Таким образом, во время измерения профиля автокорреляции (которое занимает 2–5 мин) свойства гелевых и жидких доменов могут в определенной степени усредняться. Мы исследовали эту возможность теоретически, изменив скорость переворота состояния (шаги Глаубера) по сравнению с шагами диффузии (шаги Кавасаки) в моделировании (, справа ).

В моделировании, показанном в, мы приняли решение войти в процедуру Монте-Карло, выполняя шаги Глаубера с аналогичной частотой ( r _{состояние} ), чем выполнение шагов диффузии Кавасаки в жидкой фазе ( r ( f _{c, g} = 0)). Как описано выше, мы использовали эти частоты для введения временных рамок в моделирование. В действительности временные рамки переворота и диффузии жидкости, вероятно, будут разными. Частота принятия решения об изменении состояния цепи тесно связана со шкалой времени релаксации флуктуаций состояния липидной системы (Grabitz et al., 2002). Мы исследовали различные соотношения частот ступеней Глаубера и Кавасаки (, справа ). Сравнивались соотношения: r _{состояние} : r ( f _{c, g} = 0) = 1: 1, 1: 100, 1: 1000 и 1: ∞ (изменение состояния липидов отключено). . Последние числа означают, что обмен ближайшими соседями в текучей среде происходит все быстрее, чем изменение состояния цепи (в последнем случае изменения состояния были полностью отключены). Могут быть обнаружены изменения в профиле автокорреляции при изменении r _{состояния} (, справа ).Амплитуда автокорреляционной кривой на больших временах увеличивается, когда изменения состояния выполняются реже.

Это показывает, что, в принципе, профиль автокорреляции содержит информацию о временных масштабах флуктуаций (аналогично релаксационному эксперименту). Фактически, некоторые профили можно было бы немного лучше описать, если бы режим медленного времени был немного более явным (см. DMPC: DSPC = 70:30, 309,2 K или DMPC: DSPC = 50:50, 303,6 K, соответственно). Однако эти различия невелики и, вероятно, находятся в пределах экспериментальной ошибки.Таким образом, мы заключаем, что тщательная оценка профилей автокорреляции также дает шкалы времени релаксации липидного состояния. Однако в настоящем исследовании мы не извлекли их из-за большого стандартного отклонения экспериментов и моделирования.

Может быть интересно отметить, что профили автокорреляции для промежуточного температурного режима в ( справа ) вполне могут быть оснащены законом аномальной диффузии, который в FCS принимает форму

(7)

, где w — фокусный радиус (Schwille et al., 1999a) и D _a — коэффициент аномальной диффузии. Параметры в подгонках профилей были

(8)

с τ в единицах количества циклов Монте-Карло. Это демонстрирует, что кажущаяся константа диффузии D _a в аппроксимациях аномального поведения диффузии изменяется, даже несмотря на то, что мы изменили только временные шкалы флуктуаций в моделировании. Константы диффузии в гелевом и жидком состояниях были одинаковыми во всех этих моделях.Это также предполагает, что физическое понимание, полученное при аппроксимации аномального поведения диффузии, может быть довольно ограниченным, если микроскопическое происхождение параметров α и D _a неизвестно.

ОБСУЖДЕНИЕ

В данной статье мы исследовали диффузию липидов в плоских мембранах двухкомпонентных липидных смесей. С этой целью мы провели флуоресцентную корреляционную спектроскопию при различных температурах и соотношениях смешивания DMPC и DSPC. Профили автокорреляции сравнивались с результатами моделирования методом Монте-Карло, в котором использовались термодинамические свойства смесей DMPC-DSPC, полученные калориметрическим методом.Поскольку моделирование методом Монте-Карло не содержит шкалы времени, они должны вводиться в моделирование с разными частотами для выполнения отдельных шагов Монте-Карло. Эти частоты были получены путем калибровки с экспериментальными данными для чистых липидных фаз из FCS. Мы пришли к теоретическому описанию, которое с хорошей точностью описывает экспериментальные данные автокорреляции. Следует отметить, что моделирование областей смешанной фазы не было попыткой подогнать экспериментальные данные, а было предсказанием, основанным на термодинамической информации.Мы считаем это важным шагом к пониманию диффузионных процессов в липидных мембранах. Моделирование методом Монте-Карло дает информацию о распределении липидов, о свойствах фаз и доменов, а также о тепловых свойствах. Степень точности, с которой были возможны предсказания диффузионных свойств, оправдывает предположение, что моделирование методом Монте-Карло дает представление о реальных системах, которое недалеко от реальности. Мы показали, что профиль автокорреляции содержит информацию не только о масштабах времени диффузии, но и о масштабах времени релаксации.Ясно, что профили автокорреляции в областях смешанной фазы не являются суперпозицией процесса диффузии в чистой жидкой фазе и другого процесса диффузии в чистой гелевой фазе (см. справа ). Это связано с тем, что состояние липида может изменяться во время прохождения через фокус микроскопа, и эти домены могут быть меньше фокального сечения. Это также означает, что профили автокорреляции на мембранах, по крайней мере в принципе, содержат информацию о временных масштабах релаксации, как мы показали в ( справа ) — хотя из-за точности данных мы не смогли разрешить эту информацию.

Настоящая модель использует моделирование решетки, выполненное методами Монте-Карло. Моделирование фазового поведения липидного бислоя методом Монте-Карло до сих пор применялось почти исключительно к монослоям (например, Mouritsen, Pink, Sugar и их соавторами). О связи между монослоями, образующими бислой, известно немного. В публикации о формировании фазы пульсации мы используем однослойное сцепление (Heimburg, 2000). Zhang et al. (1992) обнаружили, что межслойное сцепление может увеличивать кооперативность при плавлении мембраны.Тот факт, что профили теплоемкости всех смесей хорошо описываются проведенным имитационным анализом на монослоях, в определенной степени оправдывает наше предположение. Визуализация с помощью конфокальной микроскопии, по-видимому, указывает на присутствие некоторого монослоя, поскольку распределение доменов обычно идентично в обоих монослоях. Однако этот эффект, вероятно, уже будет включен в выбор параметров взаимодействия.

Диффузия липидов в мембранах измерялась различными методами, например.g., FRAP (Vaz and Almeida, 1991; Almeida et al., 1992a, b; Almeida and Vaz, 1995) и отслеживание отдельных частиц (Kusumi et al., 1993; Simson et al., 1995), которые частично был рассмотрен Сакстоном и Якобсоном (1997). В последние годы FCS становится все более популярной (Thompson, 1991; Korlach et al., 1999; Schwille et al., 1999a; Böckmann et al., 2003). Измерения FRAP и FCS имеют преимущество перед отслеживанием отдельных частиц в том, что можно легко выполнить выборку по многим событиям, имея до 100 частиц в фокусе.При отслеживании отдельных частиц может быть довольно сложно получить данные с разумной статистической значимостью (Qian et al., 1991). Другие методы измерения диффузии обсуждаются во введении.

Теоретически существуют различные модели М. Сакстона, частично рассмотренные в Saxton and Jacobson (1997) и Saxton (1999). Сакстон выделил в основном четыре типа диффузионных процессов:

1. Нормальная диффузия с 〈 r ² 〉 = 4 Dt.

2. Аномальная диффузия с 〈 r ² 〉 = 4 Dt ^α (Saxton, 1994), ( α <1).

3. Диффузия с направленным потоком с 〈 r ² 〉 = 4 Dt + ( Vt ) ² .

4. Загонное движение, при котором молекулы могут свободно диффундировать в ограниченных отсеках внутри мембраны (Saxton, 1995).

В большинстве моделей Сакстон рассматривает неподвижные или подвижные препятствия (Saxton, 1987, 1990), которые препятствуют диффузии. Возможность существования перколяционных доменов была, в частности, подчеркнута Almeida и Vaz (1995) с помощью FRAP.В своих экспериментах они обнаружили, что в липидных смесях, где сосуществуют гелевая и жидкая фазы, восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания может быть медленным или неполным. Из этого они сделали вывод, что существуют доменные структуры, которые могут просачиваться. В таких условиях диффузия флуоресцентных меток в обесцвеченный участок мембраны затруднена или подавлена. Сакстон моделировал такие процессы в самоподобных перколяционных кластерах, созданных на компьютере (Saxton, 2001). Недавняя модель Полсона и др.(2001) рассчитали диффузионные свойства в мембранах, содержащих холестерин, на основе модели Пинка с 10 состояниями. Насколько нам известно, это единственная предыдущая работа (за исключением исследования, представленного здесь), в котором используется термодинамическая информация об исследуемой системе. В этом исследовании, однако, отсутствует прямое сравнение с экспериментом, который был предпринят в настоящем исследовании. Таким образом, мы считаем, что настоящее исследование дополняет наше понимание образования доменов в липидных мембранах.Наша модель предполагает, что диффузия имеет место как в гелевых, так и в жидких липидных доменах. Одним из результатов измерений FCS является то, что константа диффузии в гелевых мембранах в ∼70 раз меньше, чем в жидкой фазе ( D _{жидкость} ≈ 4 × 10 ⁻⁸ см ² в секунду). Соответствующее значение D ≈ 5 × 10 ⁻¹⁰ см ² в секунду значительно выше, чем значения, сообщаемые другими методами. Как упоминалось во введении, существует значительный диапазон значений для гелевой фазы, который зависит от времени и масштаба измерения.В нашем теоретическом анализе мы опирались на цифры, полученные от FCS. В FRAP константа диффузии в гелевой фазе предполагалась намного медленнее, и сообщалось значение до D ≈ 10 ^-16 см ² в секунду. Мы не можем полностью определить причину этого различия. Schneider et al. (1983) предположили, что это может быть связано с образованием дефектов линии в фазе пульсации. Мы предположили, что фаза пульсации состоит из периодического расположения дефектов линии жидкости (Heimburg, 2000).Фактически, на многие из наших экспериментов с гелевой фазой может влиять формирование ряби. Это также может объяснить отсутствие поляризационных эффектов в наших экспериментах с гелевой фазой. Корлач и др. (1999) обнаружили константы диффузии в смесях DLPC-DPPC, которые находятся в найденном нами диапазоне ( D _{жидкость} = 3,9 × 10 ⁻⁸ см ² в секунду и D _гель = 2,1 × 10 ⁻¹⁰ см ² в секунду соответственно). Аналогичные значения были также сообщены в более ранней литературе для чистых пузырьков DPPC (Schneider and Webb, 1987).Процессы диффузии, измеренные с помощью FCS, на удивление хорошо описаны с помощью моделирования Монте-Карло.

Наше моделирование имеет несколько преимуществ по сравнению с моделями Сакстона (которые обычно носят более общий характер, но менее приспособлены к конкретной задаче):

1. Термодинамические параметры липидной смеси учитываются правильно, что означает, что наша модель делает правильные прогнозы. для всех соотношений компонентов и температур смешивания.

2. Модель учитывает изменение времен релаксации.

Если мы рассматриваем домен геля как мягкое препятствие (это означает, что диффузия в таких доменах медленнее, но не запрещена), это препятствие может растворяться за счет колебаний липидного состояния во время измерения или во время прохождения метки через микроскопический фокус. Однако колебания состояния — это внутреннее свойство липидных мембран. Различия в наблюдаемой константе диффузии между FCS и FRAP могут зависеть от объема и времени наблюдения. Выбор флуоресцентной метки также может играть роль, поскольку метка, которая не разделяется на гелевые домены, будет рассматривать их как препятствия, даже если диффузия других молекул в этих доменах будет быстрой.Мы постарались исключить такую ​​возможность выбором нашего лейбла. При моделировании эффекты конечного размера в режимах фазового пространства с макроскопическим разделением фаз также могут привести к недооценке диффузии на большие расстояния.

В этом исследовании мы также можем выполнять отслеживание отдельных частиц во время моделирования (данные не показаны). Информацию о режиме диффузии можно получить, построив график 〈 r ² 〉 / t как функцию времени, что требует очень длинных трасс диффузии для уменьшения погрешностей (Qian et al., 1991), обычно> 2 000 000 шагов Монте-Карло, усредненных по нескольким десяткам частиц. Основной результат такого анализа состоит в том, что в режиме плавления липидных смесей существует три основных временных режима диффузии. Для коротких процессов распространение происходит просто (, случай 1, , выше), потому что метка распространяется в пределах одного домена. В промежуточных временных масштабах диффузия является аномальной (, случай 2 , выше, показывает фрактальный коэффициент α <1), потому что метки иногда находятся в геле, а иногда в жидкой среде и исследуют неоднородность системы, когда формируются области и размеры могут быть сложными.При больших временных масштабах диффузия снова становится простой ( случай 1 , выше), потому что флуктуации липидной матрицы усредняют неоднородности во временных масштабах, больших, чем время релаксации липидной матрицы. Таким образом, очевидно, важно, имеют ли препятствия срок службы или они постоянны. Наши результаты по траекториям одиночных частиц будут подробно описаны в будущих публикациях.

Из корреляции энтальпии мы обнаружили, что типичные временные рамки флуктуаций размера домена очень зависят от температуры и состава и могут быть медленнее или быстрее, чем типичное время пребывания метки в фокусе.На одной из показанных кривых (DMPC: DSPC 50:50 при 303,6 К, для изменения липидного состояния на липидный обмен в соотношении 1: 1) можно наблюдать двойное время релаксации до 3 × 10 ⁴ Циклы Монте-Карло, соответствующие ∼1 с в экспериментальном масштабе (см. Сравнение масштабов Монте-Карло с экспериментальными временными шкалами в). Поскольку мы пришли к выводу из небольшого недооценки профиля автокорреляции FCS в режиме смешанной фазы при более длительных временах, коэффициент переворота может быть больше (например,г., 1: 1000 или более; см. справа ), временные рамки релаксации могут быть скорее в режиме ≥1000 с. В экспериментах по флуоресценции и тушению инфракрасного излучения, проведенных Jørgensen et al. (2000) было обнаружено, что для смесей ПК DC ₁₆ PC-DC ₂₂ релаксация может длиться до 30 минут или более. Хотя мы не смогли адекватно определить время релаксации из нашего эксперимента FCS, эти значения вполне возможны в рамках нашего анализа. Однако следует отметить, что вся экспериментальная ситуация в Jørgensen et al.(2000) соответствовали очень большому отклонению от равновесия, сопровождаемому большими перестройками состава, тогда как наши симуляции представляют собой симуляции равновесия только с небольшими флуктуациями вокруг среднего значения с небольшими перестройками состава. Следовательно, их данные могут завышать время релаксации в смешанных липидных системах.

Автокорреляция флуктуаций энтальпии смеси DMPC: DSPC из моделирования (, центральная панель, ), указывающая время релаксации липидного состояния (Grabitz et al., 2002). Типичные ступени флуктуаций энтальпии дают время релаксации липидного состояния (с). Релаксация при максимуме c _P при 303,6 К является самой медленной, тогда как она наиболее быстрая в чистом геле (290,5 К) и жидкой фазе (322,5 К). Время релаксации при 303,6 К составляет от 10 ¹ до 10 ⁵ циклов Монте-Карло, тогда как среднее время пребывания метки составляет ~ 10 ³ цикл. Это указывает на то, что процессы релаксации могут протекать медленнее, чем время, которое метка проводит в фокусе микроскопа.Для моделирования гелевой и жидкой фаз (290,5 К и 322,5 К соответственно) релаксация происходит быстрее, чем время пребывания этикетки в фокусе (см. Центральную панель , ).

Мы принимаем хорошее соответствие между моделированием и экспериментом FCS как указание на то, что пространственная картина, созданная с помощью снимков Монте-Карло, недалеко от истины. Это также может помочь интерпретировать изображения конфокальной микроскопии, такие как те, что показаны на ( правая панель ). Во-первых, снимки показывают, что существование доменов не идентично макроскопическому разделению фаз.Снимки при T = 305 K и T = 317 K показывают макроскопическое разделение фазы преимущественно жидкого характера (содержащей несколько небольших кластеров геля) и фазы преимущественно гелевого характера (содержащей некоторые кластеры жидкости). Снимок при 302 К показывает небольшие жидкие домены в липидной матрице геля. Обратный случай можно увидеть при 319 К, когда небольшие гелевые домены обнаруживаются в жидкой матрице.

Таким образом, мы находим два разных случая:

1. Разделение на две фазы, идентичное разделению на две макроскопические области (содержащие небольшие области другого состояния) в масштабе длины бокса моделирования, которые растут с размером системы.Насколько нам известно, экспериментально размеры доменов никогда не изучались систематически в зависимости от размера везикул. Однако в некоторых исследованиях конфокальной микроскопии были описаны везикулы, которые демонстрируют макроскопическое разделение всего на два домена с упорядоченными и неупорядоченными цепями (например, Baumgart et al., 2003).

2. Домены меньше, чем система моделирования, и не растут с размером системы. Это можно проверить в моделировании, увеличив размер матрицы, или в эксперименте на гигантских пузырьках для пузырьков различного размера.Такой анализ называется масштабированием конечного размера (Ли и Костерлиц, 1991).

Примером для такого случая могут служить наблюдения Келлера и МакКоннелла (1999) относительно монослоев бинарных липидных смесей, близких к критическим точкам смешиваемости. Были замечены небольшие домены с размерами, зависящими от расстояния от критической точки. В этой статье это объясняется конкуренцией между линейным натяжением на границах раздела доменов и электростатическим дипольным отталкиванием.По нашему мнению, образование этого домена соответствует критическим колебаниям в бинарной липидной матрице. Для системы, обсуждаемой здесь, масштабирование конечного размера было выполнено в Seeger et al., 2005).

Когда домены не являются макроскопическими, флуктуации на единицу числа молекул не зависят от размера системы (Иванова и Хаймбург, 2001), а длина всего интерфейса домена пропорциональна размеру мембраны (или везикулы). Мы показали для пептидсодержащих систем, что границы раздела доменов являются областями больших флуктуаций (Иванова и др., 2003). Поскольку теплоемкость, упругие постоянные и шкалы времени релаксации являются функцией флуктуаций (Heimburg, 1998; Grabitz et al., 2002), разница между системой с макроскопическим разделением фаз и системой с микроскопическими флуктуациями (без макроскопического разделения фаз) может быть глубоким. Это также означает, что наличие аномалий теплоемкости не означает автоматически, что существует переход (первого рода), и что использование внешних границ профиля теплоемкости для построения фазовой диаграммы или анализа областей доменов в конфокальной микроскопии (как было сделано, например, Feigenson and Buboltz, 2001), может вводить в заблуждение не только потому, что домены могут существовать внутри доменов, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть в микроскоп.Sugar et al. (2001) обсудили это более подробно, проанализировав распределение размеров доменов как функцию температуры и состава в смесях DMPC: DSPC. Они обнаружили, что режим разделения фаз не совпадает с внешними пределами профилей теплоемкости. Это также означает, что обнаружение доменов на изображении конфокальной микроскопии () может указывать на наличие режима разделения фаз. Интерпретация, конечно, осложняется тем фактом, что везикулы демонстрируют кривизну поверхности, которая влияет на фазовое поведение и приводит к перестройке доменов (Baumgart et al., 2003). В продолжающемся обсуждении физической реальности плотов в биомембранах очень важно решить, представляют ли эти наноскопические домены фазы (что означает, что они стабильны) или они являются флуктуациями (что означает, что они являются нестабильными доменами, которые колеблются в состоянии, размер и время). Важное различие заключается в том, насколько чувствительно такие домены реагируют на изменения окружающей среды и реагируют ли такие доменные структуры на контролируемые параметры в клетке (например,, pH). Авторы этого исследования поддерживают такую ​​точку зрения, потому что она сделает плоты управляемым элементом системы, что должно быть в интересах организма. Однако возможность того, что плоты будут устойчивыми единицами, на основании настоящих экспериментов не исключена. Статья, в которой обсуждаются аспекты масштабирования конечного размера и взаимосвязь между размером домена и флуктуациями на границах домена, находится в процессе подачи заявки Сигером и др., 2005.

Подводя итог, мы представили здесь диффузионное исследование мембран, которые напрямую связывает термодинамическую информацию с диффузионными экспериментами.В этом объединенном исследовании FCS и моделирования методом Монте-Карло мы продемонстрировали, что процессы диффузии в липидных смесях могут быть хорошо поняты на основе извлечения термодинамических свойств липидных смесей из калориметрии. Моделирование методом Монте-Карло представляет собой инструмент для определения соответствующих параметров, ведущих к реалистичным прогнозам образования доменов и флуктуаций липидного состояния и положения, что в будущем может помочь понять физическую природу доменов в сложных мембранах.

Благодарности

Мы признательны профессору CAM Seidel (Университет Дюссельдорфа) и сотрудникам (особенно Карлу Сандхагену), а также доктору Райнеру Хайнцманну (MPI for Biophysical Chemistry, Göttingen) за ценные комментарии и помощь в настройке. вверх по нашему отделу FCS. Кроме того, мы благодарим Макса Шах за его вычислительные работы на ранней стадии этого проекта и Томаса Шлётцера за его усилия по разработке методов выращивания пузырьков на покровных стеклах ITO.

Настоящее исследование поддержано Фондом Volkswagen (А.Х. и Т.Х.).

Примечания

Х. М. Сигер и А. Э. Хак внесли равный вклад в эту работу.

Используемые сокращения: BODIPY-C16-PC, 2- (4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен-3-пентаноил) -1-гексадеканоил — sn -глицеро-3-фосфохолин; DiI-C18, 1,1′-диоктадецил-3,3,3 ‘, 3’-тетраметилиндокарбоцианин; DLPC, дилауроилфосфатидилхолин; DMPC, димиристоилфосфатидилхолин; DPPC, дипальмитоилфосфатидилхолин; DSPC, дистеароилфосфатидилхолин; FCS — флуоресцентная корреляционная спектроскопия; MC, Монте-Карло; ТРИТЦ-ДППЭ, N- (6-тетраметилродаминтиокарбамоил) -1,2-дигексадеканоил- sn -глицеро-3-фосфоэтаноламин.

Ссылки

• Almeida, P. F. F., and W. L. C. Vaz. 1995. Боковая диффузия в мембранах. В Структура и динамика мембран: от клеток к пузырькам. Р. Липовски и Э. Сакманн, редакторы. Эльзевир, Амстердам, Нидерланды. 305–357.
• Алмейда, П. Ф. Ф., В. Л. К. Ваз и Т. Э. Томпсон. 1992a. Боковая диффузия и перколяция в двухфазных, двухкомпонентных липидных бислоях. Топология твердофазных доменов в плоскости и поперек липидного бислоя.Биохимия. 31: 7198–7210. [PubMed] [Google Scholar]
• Алмейда, П. Ф. Ф., В. Л. С. Ваз и Т. Э. Томпсон. 1992b. Боковая диффузия в жидких фазах липидных бислоев димиристоилфосфатидилхолин / холестерин: анализ свободного объема. Биохимия. 31: 6739–6747. [PubMed] [Google Scholar]
• Ангелова, М. И., С. Соло, П. Мелеард, Дж. Ф. Фокон и П. Боторел. 1992. Получение гигантских пузырьков внешними электрическими полями переменного тока. Прогр. Коллоидный полим. Sci. 89: 127–131. [Google Scholar]
• Багатолли, Л.А. и Э. Граттон. 1999. Двухфотонная флуоресцентная микроскопия: наблюдение изменений формы при фазовом переходе в гигантских однослойных везикулах фосфолипидов. Биофиз. Дж. 77: 2090–2101. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Багатолли, Л. А. и Э. Граттон. 2000a. Корреляция между формой липидного домена и составом смеси бинарных фосфолипидов в отдельно стоящих бислоях: двухфотонная флуоресцентная микроскопия. Биофиз. Дж. 79: 434–447. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Багатолли, Л.А. и Э. Граттон. 2000b. Двухфотонная флуоресцентная микроскопия сосуществующих липидных доменов в гигантских однослойных везикулах бинарных смесей фосфолипидов. Биофиз. Дж. 78: 290–305. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Багнат, М., С. Керанен, А. Шевченко и К. Симонс. 2000. Липидные рафты участвуют в биосинтетической доставке белков к клеточной поверхности дрожжей. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 97: 3254–3259. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Баумгарт, Т., С. Т.Hess и W. W. Webb. 2003. Отображение сосуществующих жидких доменов в моделях биомембран, сочетающих кривизну и линейное натяжение. Природа. 425: 821–824. [PubMed] [Google Scholar]
• Блюм, А. 1993. Динамические свойства. В Справочнике по фосфолипидам . Г. Севц, редактор. Марсель Деккер, Нью-Йорк. 455–509.
• Бёкманн, Р. А., А. Хак, Т. Хаймбург и Х. Грубмюллер. 2003. Влияние хлорида натрия на липидный бислой. Биофиз. Дж. 858: 1647–1655. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Brown, D.А. и Э. Лондон. 1998. Функции липидных рафтов в биологических мембранах. Анну. Rev. Cell Dev. Биол. 14: 111–136. [PubMed] [Google Scholar]
• Калверт, Дж. Г. и Дж. Н. Дж. Питтс. 1966. Фотохимия. Вили, Нью-Йорк.
• Едидин М. 2003. Состояние липидных рафтов: от модельных мембран к клеткам. Анну. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32: 257–283. [PubMed] [Google Scholar]
• Эйген, М. и Р. Риглер. 1994. Сортировка одиночных молекул: приложение к диагностической и эволюционной биотехнологии.Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 91: 5740–5747. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Einstein, A. 1905. Uber die von der molkularkinetischen Theorie der Wärme geforderte Bewegung von in ruhenden Flüssigkeiten Suspendierten Teilchen. Annals Phys. 17: 549–560. [О движении мелких частиц, взвешенных в неподвижных жидкостях, требуемом молекулярно-кинетической теорией тепла.] [Google Scholar]
• Эйнштейн, А. 1906. Zur Theorie der Brownschen Bewegung. Annals Phys. 19: 371–381.[К теории броуновского движения.] [Google Scholar]
• Фейгенсон, Г. У., и Дж. Т. Бубольц. 2001. Тройная фазовая диаграмма дипальмитоил-ПК / дилауроил-ПК / холестерин: формирование наноскопических доменов под действием холестерина. Биофиз. Дж. 80: 2775–2788. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Фишер, Р. В. 1978. Боковая диффузия молекулы фосфолипида в бислоев дипальмитоилфосфатидилхолина. Исследование с использованием ядерной спин-решеточной релаксации во вращающейся системе отсчета. Биохимия.17: 1177–1183. [PubMed] [Google Scholar]
• Галла, Х. Дж., У. Хартманн, У. Тейлен и Э. Сакманн. 1979. О двумерном пассивном случайном блуждании в липидных бислоях и жидкостных путях в биомембранах. J. Membr. Биол. 48: 215–236. [PubMed] [Google Scholar]
• Глаубер, Р. Дж. 1963. Зависящая от времени статистика модели Изинга. J. Math. Phys. 2: 294–307. [Google Scholar]
• Грабиц, П., В. П. Иванова и Т. Хаймбург. 2002. Кинетика релаксации липидных мембран и ее связь с теплоемкостью.Биофиз. Дж. 82: 299–309. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хардер, Т., П. Шайффеле, П. Веркаде и К. Саймонс. 1998. Липидная доменная структура плазматической мембраны, выявленная при наложении мембранных компонентов. J. Cell Biol. 141: 929–942. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Harms, GS, L. Cognet, PHM Lommerse, GA Blab, H. Kahr, R. Gamsjager, HP Spaink, NM Soldatov, C. Romanin, T. Schmidt . 2001. Визуализация одной молекулы каналов Ca ²⁺ L-типа в живых клетках.Биофиз. Дж. 81: 2639–2646. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хармс, Г. С., М. Зоннлейтнер, Г. Дж. Шютц, Х. Дж. Грубер и Т. Шмидт. 1999. Построение изображений анизотропии одиночных молекул. Биофиз. Дж. 77: 2864–2870. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Heimburg, T. 1998. Механические аспекты термодинамики мембран. Оценка механических свойств липидных мембран, близких к переходу цепное плавление из калориметрии. Биохим. Биофиз. Acta. 1415: 147–162.[PubMed] [Google Scholar]
• Heimburg, T. 2000. Модель предварительного перехода липидов: связь образования ряби с переходом плавление цепи. Биофиз. Дж. 78: 1154–1165. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хаймбург, Т. и Р. Л. Билтонен. 1996. Исследование с помощью моделирования методом Монте-Карло изменений теплоемкости, вызванных белками. Биофиз. Дж. 70: 84–96. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Hess, S. T. и W. W. Webb. 2002. Оптика фокусного объема и экспериментальные артефакты в конфокальной флуоресцентной корреляционной спектроскопии.Биофиз. Дж. 83: 2300–2317. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Иванова, В. П. и Т. Хаймбург. 2001. Метод гистограммы для определения теплоемкости липидных монослоев, изогнутых бислоев и мембран, содержащих пептиды. Phys. Преподобный Э. 63: 1914–1925. [PubMed] [Google Scholar]
• Иванова, В. П., И. М. Макаров, Т. Э. Шеффер и Т. Хаймбург. 2003. Анализ профилей теплоемкости пептидсодержащих мембран: образование кластеров грамицидина A. Biophys. Дж. 84: 2427–2439.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Йоргенсен, К., А. Клингер и Р. Л. Билтонен. 2000. Неравновесный рост липидных доменов в двухфазной области гель-жидкость липидной смеси DC16PC-DC22PC исследован с помощью компьютерного моделирования методом Монте-Карло, FT-IR и флуоресцентной спектроскопии. J. Phys. Chem. Б. 104: 11763–11773. [Google Scholar]
• Келлер, С. Л. и Х. М. МакКоннелл. 1999. Полосовые фазы в липидных монослоях вблизи критической точки смешиваемости. Phys. Rev. Lett. 82: 1602–1605.[Google Scholar]
• Кениг, С., Т. Байерл, Г. Кодденс, Д. Рихтер и Э. Сакманн. 1995. Гидратационная зависимость динамики цепей и локальной диффузии в мультислоях l- α -дипальмитоилфосфтидилхолина исследована методом некогерентного квазиупругого рассеяния нейтронов. Биофиз. Дж. 68: 1871–1880. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Кёниг, С., В. Пфайффер, Т. Байерл, Д. Рихтер и Э. Сакманн. 1992. Молекулярная динамика липидных бислоев изучается методом некогерентного квазиупругого рассеяния нейтронов.J. Phys. II (пт). 2: 1589–1615. [Google Scholar]
• Korlach, J. J., P. Schwille, W. W. Webb и G. W. Feigenson. 1999. Характеристика фаз липидного бислоя методами конфокальной микроскопии и флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 96: 8461–8466. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Куо, А. Л. и К. Г. Уэйд. 1999. Боковая диффузия липидов с помощью импульсного ядерного магнитного резонанса. Биофиз. Дж. 77: 2300–2308. [PubMed] [Google Scholar]
• Кусуми, А., Ю. Сако и М. Ямамото. 1993. Ограниченная латеральная диффузия мембранных рецепторов, как изучено с помощью отслеживания одиночных частиц (нановидная микроскопия). Эффект дифференцировки, индуцированной кальцием. Биофиз. Дж. 65: 2021–2040. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ланг, Т., Д. Брунс, Д. Венцель, Д. Ридель, П. Холройд, К. Тиле и Р. Ян. 2001. Ловушки сконцентрированы в холестерин-зависимых кластерах, которые определяют места стыковки и слияния для экзоцитоза. EMBO J. 20: 2202–2213. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ли, А.Г. 1977. Липидные фазовые переходы и фазовые диаграммы. II. Смеси с липидами. Биохим. Биофиз. Acta. 472: 285–344. [PubMed] [Google Scholar]
• Ли Дж. И Дж. М. Костерлиц. 1991. Масштабирование конечных размеров и моделирование фазовых переходов первого рода методом Монте-Карло. Phys. Преподобный Б. 43: 3265–3277. [PubMed] [Google Scholar]
• Magde, D., E. Elson, and W. W. Webb. 1972. Термодинамические флуктуации в реагирующей системе: измерение методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Phys. Ред.Lett. 29: 705–708. [Google Scholar]
• Mouritsen, O. G. 1998. Самосборка и организация липидно-белковых мембран. Curr. Opin. Коллоидный интерфейс Sci. 3: 78–87. [Google Scholar]
• Моуритсен, О. Г. и М. Блум. 1984. Матрасная модель липид-белковых взаимодействий в мембранах. Биофиз. Дж. 46: 141–153. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Моуритсен, О. Г., А. Бутройд, Р. Харрис, Н. Ян, Т. Лукман, Л. Макдональд, Д. А. Пинк и М. Дж. Цукерманн. 1983. Компьютерное моделирование основного фазового перехода гель-жидкость липидных бислоев.J. Chem. Phys. 79: 2027–2041. [Google Scholar]
• Моуритсен, О. Г. и К. Йоргенсен. 1995. Микро-, нано- и мезомасштабная неоднородность липидных бислоев и ее влияние на макроскопические свойства мембран. Мол. Membr. Биол. 12: 15–20. [PubMed] [Google Scholar]
• Нильсен, Л. К., Т. Бьёрнхольм и О. Г. Моуритсен. 2000a. Критические явления — колебания, зафиксированные в действии. Природа. 404: 352. [PubMed] [Google Scholar]
• Нильсен, Л. К., А. Вишняков, К. Йоргенсен, Т. Бьёрнхольм и О.Г. Моуритсен. 2000b. Структура жидких липидных мембран в нанометровом масштабе. J. Phys. Конденс. Иметь значение. 12: 309–314. [Google Scholar]
• Орад, Г., Дж. Линдблом и П. В. Вестерман. 2002. Боковая диффузия холестерина и димиристоилфосфатидилхолина в липидном бислое, измеренная с помощью спектроскопии ЯМР в градиенте импульсного поля. Биофиз. Дж. 83: 2702–2704. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Полсон, Дж. М., И. Ваттулайнен, Х. Чжу и М. Дж. Цукерманн. 2001. Имитационное исследование латеральной диффузии в двухслойных смесях липид-стерол.Евро. Phys. Дж. Э. 5: 485–497. [Google Scholar]
• Праманик А., П. Тайберг и Р. Риглер. 2000. Молекулярные взаимодействия пептида с мембранами фосфолипидных везикул по данным флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Chem. Phys. Lett. 104: 35–47. [PubMed] [Google Scholar]
• Press, W. H., S. A. Teukolsky, W. T. Vetterling и B.P. Flannery. 1997. Случайные числа. В Числовые рецепты на C, 2-е изд. Издательство Кембриджского университета, Кембридж, Великобритания. 274–283.
• Цянь, Х., М. П. Шитц и Э. Л. Элсон. 1991. Отслеживание отдельных частиц: анализ диффузии и потока в двумерных системах. Биофиз. Дж. 60: 910–921. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ритвельд, А. и К. Саймонс. 1998. Дифференциальная смешиваемость липидов как основа для образования функциональных мембранных рафтов. Биохим. Биофиз. Acta. 1376: 467–479. [PubMed] [Google Scholar]
• Rigler, R., U. Mets, J. Widengren, and P. Kask. 1993. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия с высокой скоростью счета и низким фоном: анализ поступательной диффузии.Евро. Биофиз. Дж. 22: 169–175. [Google Scholar]
• Саффман, П. Г. и М. Дельбрюк. 1975. Броуновское движение в биологических мембранах. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 72: 3111–3113. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Saxton, M. J. 1987. Боковое распространение на архипелаге. Эффект подвижных препятствий. Биофиз. Дж. 52: 989–997. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сакстон, М. Дж. 1990. Боковая диффузия в смеси подвижных и неподвижных частиц: исследование Монте-Карло.Биофиз. Дж. 58: 1303–1306. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Saxton, M. J. 1993a. Боковая диффузия на архипелаге: зависимость от размера трассера. Биофиз. Дж. 64: 1053–1062. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Saxton, M. J. 1993b. Трекинг одиночных частиц: эффекты загонов. Биофиз. Дж. 65: 389–398. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сакстон, М. Дж. 1994. Аномальная диффузия из-за препятствий: исследование Монте-Карло. Биофиз. Дж. 66: 394–401.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Saxton, M. J. 1995. Отслеживание отдельных частиц: эффект загонов. Биофиз. Дж. 69: 389–398. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Saxton, M. J. 1999. Боковая диффузия липидов и белков. Curr. Верхний. Membr. 48: 229–282. [Google Scholar]
• Сакстон, М. Дж. 2001. Аномальная субдиффузия при восстановлении флюоресцентного фотообесцвечивания: исследование Монте-Карло. Биофиз. Дж. 81: 2226–2240. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Saxton, M.Дж. И К. Якобсон. 1997. Отслеживание отдельных частиц: приложения к динамике мембран. Анну. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 373–399. [PubMed] [Google Scholar]
• Schmidt, T., G. J. Schütz, W. Baumgärtner, H. J. Gruber и H. Schindler. 1995. Характеристика фотофизики и подвижности одиночных молекул в жидкой липидной мембране. J. Phys. Chem. 99: 17662–17668. [Google Scholar]
• Schmidt, T., G. J. Schütz, W. Baumgärtner, H. J. Gruber и H. Schindler. 1996. Визуализация диффузии одиночных молекул.Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 93: 2926–2929. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Шнайдер, М. Б., В. К. Чан и В. В. Уэбб. 1983. Быстрая диффузия по дефектам и гофрам в жидких кристаллах фосфолипида P ‘ _β . Биофиз. Дж. 43: 157–165. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Schneider, M. B., and W. W. Webb. 1987. Динамика липидной мембраны: биологические клетки, везикулы и смектические жидкие кристаллы. В Физика сложных и надмолекулярных жидкостей.С.А.Сафран и Н.А.Кларк, редакторы. 179–208. Вайли.
• Schütz, G.J., H. Schindler, and T. Schmidt. 1997. Одномолекулярная микроскопия модельных мембран обнаруживает аномальную диффузию. Биофиз. Дж. 73: 1073–1080. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Schwille, P., U. Haupts, S. Maiti, and W. W. Webb. 1999a. Молекулярная динамика в живых клетках, наблюдаемая с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии с одно- и двухфотонным возбуждением. Биофиз. Дж. 77: 2251–2265. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Schwille, P., J. Korlach и W. W. Webb. 1999b. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия с чувствительностью отдельных молекул на клеточных и модельных мембранах. Цитометрия. 36: 176–182. [PubMed] [Google Scholar]
• Сигер, Х., М. Фидорра и Т. Хаймбург. 2005. Размер домена и флуктуации на границах домена в липидных смесях. Макромолекулярные симпозиумы. Под давлением.
• Simons, K., and E. Ikonen. 1997. Функциональные рафты в клеточных мембранах. Природа. 387: 569–572. [PubMed] [Google Scholar]
• Саймонс, К., и Д. Тоомре. 2000. Липидные рафты и передача сигналов. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1: 31–39. [PubMed] [Google Scholar]
• Симсон, Р., Э. Д. Шитс и К. Якобсон. 1995. Обнаружение временного латерального ограничения мембранных белков с помощью анализа отслеживания одиночных частиц. Биофиз. Дж. 69: 989–993. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сингер, С. Дж. И Г. Л. Николсон. 1972. Модель жидкой мозаики. Наука. 175: 720–731. [PubMed] [Google Scholar]
• Зоннлейтнер, А., G. J. Schütz и T. Schmidt. 1999. Свободное броуновское движение отдельных липидных молекул в биомембранах. Биофиз. Дж. 77: 2638–2642. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сперотто, М. М., Дж. Х. Ипсен и О. Г. Моуритсен. 1989. Теория латерального фазового разделения, индуцированного белками, в липидных мембранах. Cell Biophys. 14: 79–95. [PubMed] [Google Scholar]
• Шугар, И. П., Р. Л. Билтонен и Н. Митчард. 1994. Моделирование мембран методом Монте-Карло: фазовый переход малых однослойных дипальмитоилфосфатидилхолиновых везикул.Методы Энзимол. 240: 569–593. [PubMed] [Google Scholar]
• Шугар, И. П., Э. Миханова-Алексова и П. Чонг. 2001. Геометрические свойства гелевых и жидких кластеров в двойных слоях DMPC / DSPC: подход моделирования методом Монте-Карло с использованием модели с двумя состояниями. Биофиз. Дж. 81: 2425–2441. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Шугар, И. П., Т. Э. Томпсон и Р. Л. Билтонен. 1999. Моделирование двухкомпонентных бислоев методом Монте-Карло: смеси DMPC / DSPC. Биофиз. Дж. 76: 2099–2110. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Табони, Дж., и Б. Перли. 1990. Измерения квазиупругого рассеяния нейтронов быстрой локальной поступательной диффузии липидных молекул в фосфолипидных бислоях. Биохим. Биофиз. Acta. 1063: 67–72. [PubMed] [Google Scholar]
• Томпсон, Н. Л. 1991. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия. В разделе Темы флуоресцентной спектроскопии, Vol. 1. J.R. Lakowicz, редактор. Пленум Пресс, Нью-Йорк. 337–378.
• van Osdol, W. W., R. L. Biltonen и M. L. Johnson. 1989. Измерение кинетики мембранного фазового перехода.J. Bioenerg. Биофиз. Методы. 20: 1–46. [PubMed] [Google Scholar]
• ван Осдол, В. У., М. Л. Джонсон, К. Йе и Р. Л. Билтонен. 1991. Динамика релаксации геля к жидкокристаллическому переходу бислоев фосфатидилхолина. Влияние длины цепи и размера пузырьков. Биофиз. Дж. 59: 775–785. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Vaz, W. L. C. и P. F. Almeida. 1991. Микроскопическая и макроскопическая диффузия в однокомпонентных жидкофазных липидных двухслойных мембранах.Биофиз. Дж. 60: 1553–1554. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Vaz, W. L. C., E. C. C. Melo и T. E. Thompson. 1989. Трансляционная диффузия и соединение жидких доменов в двухкомпонентном двухфазном фосфолипидном бислое. Биофиз. Дж. 56: 869–876. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Vaz, W. L. C., E. C. C. Melo и T. E. Thompson. 1990. Связность жидкой фазы в изоморфном, двухкомпонентном, двухфазном бислое фосфатидилхолина. Биофиз. Дж. 58: 273–275.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wohland, T., R. Rigler, and H. Vogel. 2001. Стандартное отклонение в флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Биофиз. Дж. 80: 2987–2999. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zhang, Z., M. J. Zuckermann, and O. G. Mouritsen. 1992. Влияние межмонослойной связи на фазовое поведение липидных бислоев. Phys. Преподобный А. 46: 6707–6713. [PubMed] [Google Scholar]

Вычислительная коррекция эффекта числа копий улучшает специфичность скрининговых тестов CRISPR-Cas9 в раковых клетках

Аннотация

Система CRISPR-Cas9 произвела революцию в редактировании генов как отдельных генов, так и в случае мультиплексной потери функциональные экраны, позволяющие точно идентифицировать в масштабе генома гены, необходимые для пролиферации и выживания раковых клеток ^1,2 .Однако в предыдущих исследованиях сообщалось, что независимый от генов антипролиферативный эффект Cas9-опосредованного расщепления ДНК затрудняет такое измерение генетической зависимости, приводя к ложноположительным результатам в областях с амплификацией числа копий ^3,4 . Мы разработали CERES, вычислительный метод для оценки уровней зависимости генов на основе экранов существенности CRISPR-Cas9 с учетом эффекта, зависящего от количества копий. В рамках наших усилий по составлению карты зависимости рака мы выполнили скрининг CRISPR-Cas9 на уровне генома по 342 линиям раковых клеток и применили CERES к этому набору данных.Мы обнаружили, что CERES снижает количество ложноположительных результатов и оценивает активность sgRNA как для этого набора данных, так и для ранее опубликованных скринингов, выполненных с различными библиотеками sgRNA. Здесь мы демонстрируем полезность этой коллекции экранов после коррекции CERES для выявления уязвимостей, специфичных для рака.

Сообщалось о значительных усилиях по использованию генетического скрининга потери функции для систематической идентификации генов, важных для пролиферации и выживания раковых клеток ^1–10 .Гены, идентифицированные с помощью этих подходов, могут отражать специфические генетические уязвимости раковых клеток, предлагая стратегии лечения и направляя разработку новых терапевтических средств. Система редактирования генома CRISPR-Cas9 зарекомендовала себя как мощный инструмент для мультиплексного скрининга благодаря относительной простоте применения и повышенной специфичности по сравнению с технологией интерференции РНК ¹¹ .

Однако мы и другие недавно наблюдали, что на измерения пролиферации клеток в скринингах потери функции CRISPR-Cas9 в масштабе генома влияет число копий генома (CN) области, на которую нацелен комплекс sgRNA-Cas9 ^{1 , 3,4} .Нацеливание Cas9 на последовательности ДНК в областях с высоким усилением CN создает множественные двухцепочечные разрывы ДНК (DSB), вызывая ген-независимый ответ на повреждение ДНК и фенотип остановки клеточного цикла G2 ³ . Этот систематический, независимый от последовательности эффект из-за расщепления ДНК (эффект числа копий ) затрудняет измерение последствий делеции гена на жизнеспособность клеток (эффект нокаута гена ) и обнаруживается даже среди амплификаций CN низкого уровня и удаления.В частности, это явление затрудняет интерпретацию экспериментов, проведенных на линиях раковых клеток, содержащих множество геномных амплификаций, поскольку гены в этих регионах представляют собой основной источник ложноположительных результатов ^3,4 . Существующие методы обработки эффекта числа копий используют схемы фильтрации ⁹ , которые исключают анализ данных изнутри усиленных областей и игнорируют эффект при низкоуровневых изменениях. Здесь мы представляем CERES, метод для оценки зависимости генов от экранов существенности при компьютерной коррекции эффекта числа копий, что позволяет беспристрастно интерпретировать зависимость генов на всех уровнях CN.

В рамках наших усилий по созданию карты зависимостей рака, каталога генетических и химических уязвимостей, специфичных для клеточных линий ^10,12 , мы провели скрининг потери функции CRISPR-Cas9 в масштабе генома в 342 линиях раковых клеток. представляли 27 клеточных линий (дополнительная таблица 1, http://depmap.org/ceres) с использованием библиотеки sgRNA Avana ¹³ (дополнительная таблица 2) и оценивали влияние введения каждой sgRNA на пролиферацию клеток (онлайн-методы). После применения мер контроля качества, ROC-анализ sgRNAs, нацеленных на «золотой стандарт», общие основные основные и второстепенные гены ¹⁴ продемонстрировал высокое качество скрининга во всех клеточных линиях ().Эта коллекция экранов примерно в десять раз превосходит масштабы существующих сопоставимых наборов данных. Чтобы подтвердить обобщаемость наших результатов в независимых скринингах, выполненных с различными библиотеками sgRNA, мы повторно проанализировали два опубликованных набора данных, полученных в результате скрининга 33 линий раковых клеток различного происхождения (GeCKOv2) ³ и 14 линий клеток AML (Wang2017) ⁹ (Дополнительный рис. 1а).

( a ) Качество скрининга для каждой клеточной линии в панели (n = 342), измеренное по площади ниже кривая рабочих характеристик приемника (AUC) для различения предопределенных наборов общих основных основных и несущественных генов.( b ) Истощение sgRNAs регрессируют по отношению к количеству идеально совпадающих сайтов геномного разреза с использованием простого линейного подбора с насыщением, которое строится для каждой клеточной линии, окрашивается по клонам и масштабируется так, чтобы медиана sgRNAs нацелена на клетку. -существенные гены находятся на -1, отмечены пунктирной линией. ( c ) Гены ранжируются по среднему истощению целевых sgRNA (средняя направляющая оценка) и наносятся на график для примерной линии клеток. Значения 0 и -1 представляют собой средние оценки несущественных и важных для клетки генов, соответственно, указанные пунктирными линиями.Ниже показаны ранги истощения генов, участвующих в фундаментальных клеточных процессах, и генов в различных диапазонах амплификации CN. ( d ) На графике нанесены медиана и межквартильный диапазон (IQR) рангов истощения для 100 наиболее амплифицированных генов на клеточную линию. Цвет указывает средний уровень амплификации этих генов. Заштрихованная область указывает IQR всех проверенных генов.

Используя данные о количестве копий генома из Энциклопедии линий раковых клеток (CCLE) ¹⁵ , мы оценили 342 клеточные линии, проверенные в нашем наборе данных Avana, на чувствительность к эффекту числа копий, как в Aguirre et al. ³ . В соответствии с предыдущими наблюдениями, взаимосвязь сохранялась в каждой клеточной линии в нашей панели, где sgRNAs, нацеленные на большее количество геномных локусов, в среднем были более истощены, часто до уровней, равных или ниже истощения sgRNAs, нацеленных на важные для клетки гены (Дополнительный рис. 1b). , в). В каждом из трех наборов данных некоторая наблюдаемая вариабельность чувствительности объяснялась мутационным статусом p53 каждой линии в CCLE (дополнительный рис. 1d).

Чтобы количественно оценить степень, в которой этот эффект уровня sgRNA транслируется в ложноположительные генные зависимости, мы ранжировали гены в каждой клеточной линии по среднему истощению их целевых sgRNA (средний справочный балл ).В примере линии клеток рака груди, HCC1419, гены высокого ранга были обогащены как генами, участвующими в фундаментальных клеточных процессах, так и генами с амплифицированным CN (). Ранги истощения 100 генов с наибольшими измерениями CN были значительно выше, чем ожидалось для большинства клеточных линий (298/342 с p <0,05, односторонний тест KS с одним образцом; дополнительный рис. 2a) и степень обогащения достоверно коррелировал со средним значением CN этих генов (Spearman ρ = 0.61, p <10 ⁻¹⁵ ), что согласуется с предыдущими исследованиями (дополнительный рис. 2b).

Чтобы отделить эффект нокаута гена от эффекта числа копий, мы разработали CERES, который с помощью вычислений моделирует измеренное истощение sgRNA ( D ) как сумму этих двух эффектов (онлайн-методы). В частности, для каждой sgRNA i и клеточной линии j, CERES предполагает следующую модель (, уравнение 1, ):

Dij = qi (∑k∈Gi (hk + gkj) + fj (∑l∈LiClj)) + oi + ε

, где ε — независимый гауссовский шумовой член с нулевым средним.Эффект нокаута гена представляет собой сумму специфических для клеточной линии ( g _kj ) и общих ( h _k ) эффектов, которые агрегированы по любому гену, на который нацелена sgRNA i ( G _i ). ). Эффект числа копий моделируется кусочно-линейным сплайном, f _j , оцениваемым по количеству целевых сайтов генома, определяемому целевыми локусами ( L _i ) и CN в каждом локусе ( C _lj ) (онлайн-методы).Кумулятивные эффекты истощения затем масштабируются с помощью ориентировочного показателя активности ( q _i ), ограниченного значениями от 0 до 1, чтобы уловить и смягчить влияние реагентов низкого качества ^13,16,17 . Член смещения o _i учитывает шум при измерении содержания sgRNA в контрольном пуле (онлайн-методы). CERES определяет эффекты нокаута гена и все другие параметры, подгоняя модель к наблюдаемым данным с помощью альтернативной регрессии наименьших квадратов (онлайн-методы).Предполагаемые эффекты нокаута гена затем масштабируются для каждой клеточной линии так, чтобы оценки 0 и -1 представляли медианные эффекты несущественных генов и общих основных основных генов, соответственно.

В качестве входных данных CERES принимает данные об истощении sgRNA и CN для всех проверенных клеточных линий. Во время процедуры вывода CERES моделирует значения истощения как сумму эффектов нокаута гена и количества копий, умноженных на параметр оценки активности руководства.Затем CERES выводит значения параметров, которые дают наибольшую вероятность наблюдаемых данных в рамках модели.

Мы применили CERES к набору данных Avana из 342 экранов важности, а также к наборам данных GeCKOv2 и Wang2017, и проанализировали предполагаемые эффекты нокаута генов (дополнительные таблицы 3-5). Как и ожидалось, CERES заметно уменьшил взаимосвязь между CN и зависимостью генов, обнаруженную в нескорректированных средних справочных оценках (дополнительный рис. 3a), и почти полностью удалил его среди невыраженных генов, определенных с использованием данных экспрессии CCLE (дополнительный рис.3б). Для каждого гена мы коррелировали его измерения CN с оценками его зависимости до и после коррекции и обнаружили, что CERES сдвинул среднюю корреляцию почти до нуля (дополнительный рис. 3c). CERES также улучшил идентификацию основных генов в 339 из 342 скрининговых обследований, что было измерено путем отзыва общих основных основных генов при 5% ложном обнаружении (FDR) несущественных генов ² , в среднем на 13,8 процентных пункта ( , Дополнительный рис. 4a) (онлайн-методы). Это улучшение было значительно лучше, чем простая линейная модель, используемая для корректировки зависимости между средним ориентировочным баллом и CN (дополнительный рис.4b) (онлайн-методы). Кроме того, CERES сохранил в среднем 134 гена на клеточную линию, которые можно было бы удалить с помощью простой схемы фильтрации. В среднем, шесть из этих отфильтрованных генов на клеточную линию получили оценку как существенные ниже порога -0,6 после коррекции CERES (дополнительный рис. 4c). Обнадеживает то, что CERES сохранил ожидаемые специфические для рака зависимости даже в амплифицированных областях, таких как KRAS в примере амплификации на хромосоме 12p линии клеток рака поджелудочной железы DAN-G (дополнительный рис.5). Кроме того, линии мутантных клеток KRAS оставались существенно обогащенными по сравнению с клеточными линиями дикого типа по зависимости от гена KRAS (), которая распространялась на другие известные онкогены (дополнительный рис. 6).