Тех характеристики лада х рей: LADA XRAY кроссовер — Официальный сайт LADA

, где R (0) — критическое расстояние по Ферстеру, , t (D), — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры.Критическое расстояние Ферстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора. Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору посредством резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается посредством комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

По идее, критическое расстояние Ферстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии. Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц.Значение R (0) (в нанометрах) можно рассчитать из следующего выражения:

, в котором k-квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (l) — интеграл перекрытия в области спектров излучения донора и поглощения акцептора (с длина волны, выраженная в нанометрах), ч представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донор-акцептор, r , величиной уравнение:

и E (T) оценивается как:

, где t (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а t (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени спектрального перекрытия между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов переходов донора и акцептора и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость передачи резонансной энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве энергии резонанса флуоресценции. передаточная пара. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии непосредственно применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в поворот зависит от k -квадрат, J (l) , h и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Ферстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неточности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости от корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (l) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Frster для обычных пар донор-акцептор RET

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( k -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Ферстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная по-прежнему оставалась в некоторой степени противоречивой.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно даются для предполагаемого значения k в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора за счет вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может находиться в диапазоне от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит к изменению рассчитанного расстояния только на 26 процентов, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимается значение 0,67. применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате k становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для вариации k в квадрате. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений k в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если не невозможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием методов резонансной спектроскопии переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предложено теорией Ферстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Большая неопределенность существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит.С другой стороны, крайние значения 0 и 4 для k -квадрат требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, а это условие вряд ли будет достигнуто. Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( k -квадрат) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (проиллюстрирована на рисунке 5) дается уравнением:

где q (T) — угол между диполем эмиссионного перехода донора и диполем абсорбционного перехода акцептора, q (D) и q (A) — углы между этими диполями и вектором соединяющий донор и акцептор, а f — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (в шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояние донор-акцептор близко к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, вычисленные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии по механизму Ферстера сложно в некоторых аспектах, но просто и надежно по его результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекул донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрических форм и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований к флуорофорам, образцу и режиму (режимам) визуализации, но практически любой вертикальный или инвертированный микроскоп можно модернизировать для микроскопии FRET (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способного наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на Рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культивирования тканей оснащен стандартной вольфрамово-галогенной лампой на столбе для исследования и записи ячейки, использующие стандартное светлое поле, фазовый контраст или дифференциальный интерференционный контраст ( DIC ) освещения.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа прикреплена стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье для получения широкоугольной флуоресценции и получения изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с помощью мультиспектрального микроскопа, показанного на рисунке 7, с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах явления, следует учитывать ряд важных практических моментов, когда измерения флуоресцентного резонансного переноса энергии проводятся с помощью оптического микроскопа:

• Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.

• Фотообесцвечивание необходимо исключить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.

• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.

• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным.Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.

• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.

• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.

• Молекула-донор должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.

• Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации ( k -квадрат). Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.

• При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результатов измерений резонансной передачи энергии.

• Поскольку резонансный перенос энергии флуоресценции требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы. Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что донорные и акцепторные молекулы расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.

• Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставляло значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации.Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, широкий спектр методов может быть использован для выполнения самого измерения. Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Обнаружение FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам.Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух величин, I (A) / I (D) , как мера FRET.Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора. Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскоп путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным тушением из-за передачи энергии.Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется стационарное изображение флуоресцентного резонансного переноса энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения. Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора.На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям. Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров.Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены путем слияния с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (а)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансной передачи энергии между двумя белками

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые очень специфичны для оптического микроскопа.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные данные, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии.Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой. В некоторых отношениях методика фотообесцвечивания доноров менее сложна, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения излучения донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод коррекции обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы донорных, FRET и акцепторных фильтров предназначены для выделения и максимизации трех специфических сигналов: донорной флуоресценции, акцепторной флуоресценции, относящейся к FRET, и непосредственно возбужденной акцепторной флуоресценции, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектрального просвечивания) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть для достижения количественных результатов в экспериментах по резонансному переносу энергии флуоресценции. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра излучения акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал излучения донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр излучения.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение для среднего времени жизни, когда регистрируется как интенсивность в установившемся состоянии, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( t ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( t ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом измерения является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может изменяться множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. резонансной передачей энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресцентных ламп, классифицируются как во временной области ( импульсных , см. Рисунок 10 (а)) и в частотной области (также называемые с фазовым разрешением ; рисунок 10 (b) )) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход с частотной областью использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной области для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( f ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( t (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( t ( D) ), позволяет вычислить значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями резонансного переноса энергии флуоресценции являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки множеством биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии посредством измерений в установившемся режиме, как обсуждалось выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Несмотря на то, что для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Джозеф Р. Лакович — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Мэрилендский университет и Институт биотехнологии Мэрилендского университета (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 г. Ист. Поль Дирак, доктор философии, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

НАЗАД К ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

Вопросы или комментарии? Отправить нам письмо.

© 1998-2021, автор — Майкл В. Дэвидсон и Государственный университет Флориды. Все права защищены. Никакие изображения, графика, сценарии или апплеты не могут быть воспроизведены или использованы каким-либо образом без разрешения правообладателей.Использование этого веб-сайта означает, что вы соглашаетесь со всеми юридическими положениями и условиями, изложенными владельцами.

Этот веб-сайт поддерживается нашей командой

Последнее изменение: пятница, 13 ноября 2015 г., 14:19

Счетчик доступа с 26 ноября 2004 г .: 83362

Для получения дополнительной информации о производителях микроскопов,

Фёрстеровский резонансный перенос энергии и усиление индуцированной белком флуоресценции как синергетические многомасштабные молекулярные линейки

Роль диффузии ориентации и разделения флуорофора в наблюдаемых сдвигах эффективности FRET

Abstract

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это широко используемый метод одиночных молекул для измерения наноразмерных расстояний от изменений безызлучательного переноса энергии между донорными и акцепторными флуорофорами.Для макромолекул и комплексов эта наблюдаемая эффективность переноса используется для вывода изменений в молекулярной конформации в различных экспериментальных условиях. Однако иногда наблюдаются сдвиги в эффективности FRET даже при наличии убедительных экспериментальных доказательств того, что конформационное состояние молекулы не изменилось. Мы исследуем способы, которыми такие расхождения могут возникнуть из-за кинетических эффектов. Мы показываем, что значительные сдвиги могут возникнуть из-за взаимодействия между кинетикой возбуждения, ориентационной диффузией флуорофоров, разделительной диффузией флуорофоров и неизлучающим тушением.

Образец цитирования: Wallace B, Atzberger PJ (2017) Фёрстеровский резонансный перенос энергии: роль диффузии ориентации и разделения флуорофора в наблюдаемых сдвигах эффективности FRET. PLoS ONE 12 (5): e0177122. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122

Редактор: Sabato D’Auria, Consiglio Nazionale delle Ricerche, ИТАЛИЯ

Поступила: 15.11.2016; Дата принятия: 21 апреля 2017 г .; Опубликовано: 19 мая 2017 г.

Авторские права: © 2017 Wallace, Atzberger.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все данные, использованные в исследовании, представлены непосредственно в документе.

Финансирование: Эта работа была поддержана карьерным грантом Национального научного фонда 0956210, Национальным научным фондом: Отделение математических наук 1616353 (www.nsf.gov) и CM4 DESC0009254 Министерства энергетики США (http://science.energy.gov/ascr/).

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

1 Введение

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — широко используемый метод измерения одиночных молекул для измерения расстояний внутри и между молекулами [1, 2]. FRET основан на безызлучательной передаче энергии между возбужденной молекулой донора и молекулой акцептора.Ферстер разработал теорию безызлучательного переноса, основанную на диполь-дипольных взаимодействиях [1, 3]. Для расстояния разделения R теория Ферстера предсказывает масштабирование эффективности передачи энергии как ∼ ( R / R ₀ ) ⁻⁶ . На практике обычно R ₀ ∼ 1 нм [1–3]. Экспериментальная реализация с использованием FRET в качестве «спектроскопической линейки» для измерения расстояний внутри отдельных молекул была введена в экспериментах Страйера и Хогланда в 1960-х годах [2, 4, 5].С этого времени FRET продолжала развиваться и стала универсальным инструментом, широко используемым в биологических науках и биотехнологиях [6–10].

В биологических науках FRET используется для сообщения о межбелковых взаимодействиях [11, 12]. На уровне одной молекулы FRET использовался для измерения расстояний между метками при характеристике структур и динамики макромолекул, включая РНК, ДНК, белки и их молекулярные комплексы [6, 13-15]. Измерения FRET, зависящие от времени, были разработаны для характеристики кинетики реакции ферментов [6, 16–18], взаимодействий лиганд-рецептор [7, 19–21], конформационной динамики белков [13, 22, 23] и движения молекул моторные белки [24, 25].

Многие типы молекул могут быть использованы для образования пары акцептор-донор в FRET. Некоторые молекулы обладают фотофизикой, которая приводит к тушению без излучения при взаимодействии с окружающими химическими частицами или внутримолекулярными химическими группами [26–30]. Это дает возможность использовать зонды FRET для сообщения о локальной концентрации химических веществ, таких как ионы металлов [26, 31] в воде или ионы Ca ⁺ , высвобождаемые во время нейрональной активности [15]. В развивающейся биотехнологии FRET также используется для разработки новых типов высокоточных сенсоров для обнаружения одиночных молекул и высокопроизводительных анализов для скрининга [7, 8, 20].

В однопарном FRET (spFRET) одна пара акцепторных и донорных молекул используется для измерения внутримолекулярных расстояний [4]. Для характеристики различных молекулярных конформационных состояний или гетерогенных состояний субпопуляций используется ратиометрический анализ для оценки эффективности переноса E [18, 32]. При повторных измерениях это обычно отображается в виде гистограммы значений эффективности E . В различных экспериментальных условиях, таких как введение денатуранта, сдвиги в наблюдаемой гистограмме эффективности интерпретируются как изменения в конформационном состоянии молекулы [6, 14, 23, 33].В недавних экспериментах Lipman et al. [34, 35], было замечено, что в некоторых ситуациях такие сдвиги FRET могут происходить даже тогда, когда нет явных изменений в конформационном состоянии. Это открытие подтверждается экспериментами, в которых рентгеновское рассеяние молекул указывает на отсутствие конформационных изменений или вовлеченная молекулярная структура по своей природе жесткая, такая как полипролиновая цепь [34, 35]. Прецедент такого изменения эффективности обусловлен свойствами среды. Эксперименты, подобные тем, что были выполнены Жангом, Фу, Лаковичем и другими [36, 37], демонстрируют, что присутствие посторонних частиц (в частности, серебра в их исследованиях) может влиять на донорно-акцепторное взаимодействие.Более того, результаты Макарова и Плакско [38] предполагают, что для гибкого полимера не только конформационное состояние, но и сквозная кинетика могут влиять на наблюдаемую эффективность FRET.

Это представляет собой важный вопрос характеристики того, как могут происходить сдвиги в эффективности FRET при очевидном отсутствии каких-либо изменений в конформационном состоянии. Мы исследуем с помощью теории и стохастического моделирования роль, которую играет кинетика возбуждения, ориентационная диффузия флуорофоров, разделительная диффузия флуорофоров и неизлучающее тушение.Наши результаты направлены на количественную оценку величины этих эффектов и помощь в определении режимов, в которых эти факторы могут влиять на экспериментальные измерения.

2 Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET)

2.1 Эффективность передачи

Эффективность FRET — это доля энергии, которая без излучения передается от донора к молекуле акцептора. Первоначально предполагается, что энергия может быть испущена только как донорный фотон или без излучения передана акцептору, чтобы в конечном итоге испускаться как акцепторный фотон.В этом случае эффективность переноса связана со скоростями испускания фотонов донора и акцептора κ _A и κ _D как (1) Мы проиллюстрируем процесс донорно-акцепторного переноса на рис. 1.

Рис. 1. Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET).

Молекула-донор возбуждается до более высокого энергетического состояния адсорбированным фотоном. Донор возвращается в свое основное состояние, испуская фотон или передавая энергию молекуле акцептора.Возбужденное состояние акцепторной молекулы релаксирует за счет испускания фотонов. Показаны два широко используемых донорно-акцепторных красителя Cy 3 и Cy 5.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g001

Для некоторых систем может быть важно учитывать также дополнительные фотохимические состояния, как в [39, 40], или передачу энергии от столкновений с другими молекулами. в растворе, что приводит к безизлучающему тушению [28–30]. Мы рассмотрим некоторые из этих эффектов в следующих разделах.

Теория Ферстера предсказывает, что скорость безызлучательного переноса κ _T зависит от расстояния разделения донора и акцептора R как (2) Это основано на диполь-дипольных взаимодействиях и разделительных расстояниях, меньших длины волны излучающего фотона [1–3]. τ _D = 1/ κ _D обозначает среднее время жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора.Характерное расстояние Ферстера R ₀ зависит от фотофизики молекул донора и акцептора через (3) N _A — это число Авогодроса, κ ² фактор, связанный с относительной ориентацией донорно-акцепторных диполь-диполей [5, 41], Φ _D — квантовый выход флуоресценция донора при отсутствии акцептора, J — интеграл перекрытия, связанный со спектром адсорбции донора и акцептора, n — показатель преломления.Более подробно см. [1–3, 5, 10, 42].

Когда вся переданная энергия немедленно излучается как акцепторный фотон, мы имеем κ _A = κ _T . Тогда зависимость эффективности FRET от расстояния может быть выражена как (4) Теория Ферстера имеет важную полезность, заключающуюся в том, что расстояние разделения донора и акцептора R может быть определено из наблюдений E . Для получения R ₀ требуется только принципиальное знание некоторых свойств фотофизики донорных и акцепторных молекул.Это позволяет использовать FRET как эффективную линейку наноразмеров для молекулярных систем [4, 23, 24, 27, 43].

2.2 Однопарный FRET для молекул, диффундирующих в свободном растворе

Чтобы получить измерения отдельных молекул для свободно диффундирующих молекул, донор обычно возбуждается, ожидая, пока отдельная молекула диффундирует в фокус лазерного луча [6, 18, 23, 24]. Когда молекула находится в области, достаточно близкой к фокальной точке лазера (в пределах фокального объема), донор возбуждается с высокой вероятностью, и происходит последовательность эмиссии донорных и акцепторных фотонов, см. Рис. 2.За время нахождения молекулы в фокальном объеме можно подсчитать количество обнаруженных донорных и акцепторных фотонов n _D , n _A . Это позволяет сделать пропорционально-метрическую оценку эффективности переноса как [18, 32] (5) Эти экспериментальные данные для эффективности FRET затем обычно объединяются для формирования гистограммы наблюдаемых эффективностей передачи энергии E . Мы отмечаем, что на практике для таких экспериментов существует ряд важных соображений, таких как разработка критериев того, когда такая последовательность излучений должна считаться значительным событием FRET или когда есть короткие длительности в фокусном объеме или дробовой шум. .

Рис. 2. Одномолекулярное событие FRET.

Событие FRET начинается, когда молекула, помеченная парой донора и акцептора, диффундирует в объем достаточно большой лазерной интенсивности вблизи фокальной точки (слева). Подсчет зарегистрированного излучения фотонов для акцептора n _A и донора n _D регистрируется до тех пор, пока молекула не диффундирует за пределы фокального объема (вверху справа). Во время возбуждения донора либо излучается фотон, либо энергия безызлучательно передается акцептору и испускается со скоростью, зависящей от конформации молекулы (внизу справа).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g002

Гистограмма эффективности дает характеристику относительных пропорций различных конформационных состояний или субпопуляций молекул, встречающихся во время измерения. Для случая гомогенных молекул в одном и том же конформационном состоянии ожидается, что гистограмма эффективности будет демонстрировать узкий пик вокруг характеристической эффективности FRET, соответствующей донарно-акцепторному разделению конформации.Тогда естественно рассматривать изменения в конформационном состоянии молекулы, ища сдвиги в местоположении пика на гистограмме FRET. Это широко используется в экспериментальной практике для характеристики биомолекулярных систем [6, 13, 14, 22].

Однако в недавних экспериментах Lipman et al. [34, 35], было обнаружено, что при некоторых обстоятельствах может происходить значительный сдвиг в гистограмме эффективности FRET, в то время как нет явного изменения в конформационном состоянии. Мы используем теорию и стохастическое моделирование, чтобы исследовать роль кинетики.Сначала мы исследуем роль вращательной и поступательной диффузии флуорофоров на шкале времени кинетики возбуждения донорных и акцепторных молекул. Затем мы рассмотрим роль дополнительных эффектов, таких как тушение без излучения.

3 Важность донорно-акцепторной кинетики

3.1 Донорно-акцепторное возбуждение и релаксация

Мы рассматриваем роль кинетики донорного и акцепторного возбуждения, переноса энергии и релаксации. Мы моделируем событие возбуждения донора как происходящее со скоростью κ _D = 1/ τ _D . τ _D — среднее время жизни возбуждения донора в отсутствие акцептора. Молекула донора в возбужденном состоянии либо релаксирует, испуская фотон со скоростью κ _D , либо передавая энергию молекуле акцептора со скоростью κ _T в соответствии с уравнением (2) . Подчеркнем, что на практике коэффициент κ _T зависит от ряда факторов.Это включает расстояние R между донором и акцептором. Это также зависит от относительной ориентации донора и акцептора, который захватывается членом κ ² в уравнении (3).

Мы исследуем, как такая зависимость передачи энергии от конфигурации донора и акцептора конкурирует с другими кинетиками возбуждения и релаксации. Для этого мы разрабатываем стохастическую модель кинетики возбуждения-релаксации и проводим моделирование вращательной и поступательной диффузии акцепторных и донорных молекул.Мы исследуем влияние этих эффектов на эффективную κ _T и наблюдали эффективность передачи FRET E .

3.2 Донорно-акцепторная ориентационная диффузия

Взаимная ориентация дипольных моментов молекул донора и акцептора может существенно влиять на эффективность передачи энергии [5, 41, 42, 44, 45]. Это видно из фактора κ ² , который вносит вклад в уравнение (3). Фактор κ определяется как [5, 41, 42] (6) Символы и обозначают единичные векторы, представляющие ориентацию дипольных моментов акцепторных и донорных молекул.Указывает единичный вектор разделения, указывающий от донора к акцептору.

Вклады от эффектов ориентации часто аппроксимируются усреднением, предполагая, что ориентация быстро распространяется изотропно в масштабе времени, намного превышающем время возбуждения донора. Часто используется усредненный фактор ориентации 〈 κ ² 〉 = 2/3, [41, 42]. Однако во многих ситуациях ориентационная диффузия может быть сопоставима с временной шкалой возбуждений или, исходя из стерики молекулярного уровня, она может не быть изотропной выборкой всех ориентаций [12, 41, 44, 46].Кроме того, даже для быстрой диффузии экспериментальные измерения часто включают небольшую выборку значений κ ² , которые могут находиться в диапазоне от 0 до 4. Это выборка из распределения с нерегулярными и асимметричными характеристиками, см. Рис. 3.

Рис. 3. Распределение фактора ориентации κ ² .

Показана случайная ориентация акцептора-донора для κ ² , которая распределена между 0 и 4. Распределение показывает хорошо известный касп при κ ² = 1 (см. Вставку).Большая часть распределения находится между κ ² = 0 и κ ² = 1 со значительным смещением в сторону κ ² = 0. Гистограмма была построена из 10 ⁷ случайной ориентации красителя. пары.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g003

Мы исследуем роль диффузии ориентации и ее роль в наблюдаемой эффективности FRET, приводящей к возможным сдвигам. Поскольку важен только относительный угол между донором и акцептором, мы можем моделировать вращательную диффузию броуновским движением по поверхности сферы [47].Это может быть выражено в сферических координатах случайным процессом (7) D _R обозначает коэффициент диффузии на поверхности, а ρ радиус сферы. Уравнения следует интерпретировать в смысле исчисления Ито [48, 49]. Символы и обозначают независимые броуновские движения. Для сферы радиусом ρ конфигурация, связанная со сферическими координатами (Θ _t , Φ _t ), должна интерпретироваться в картосовых координатах как X _t = ρ sin (Θ _t ) cos (Φ _t ), Y _t = ρ sin (Θ _t ) sin (Φ _t ) , и Z _t = ρ cos (Θ _t ).

Мы выполняем моделирование путем численного вычисления временных шагов, приближающих стохастический процесс в уравнении (7). Это достигается путем проецирования броуновского движения на поверхность сферы. В частности, мы используем пошаговую процедуру по времени (8) (9) Генерируется на каждом шаге как трехмерная гауссова случайная величина с независимыми компонентами, имеющими нулевое среднее значение и единицу дисперсии. Мы отмечаем, что этот подход позволяет избежать осложнений, связанных со сферическими координатами, за счет исключения необходимости переключать карты координат, когда конфигурации приближаются к вырождениям около полюсов сферы [50].

Мы характеризуем временной масштаб вращательной диффузии как τ _R = 4 π ² ρ ² / D _R . Мы используем для красителя длину ρ = 1 нм и окружность сферы 2 πρ . Окружность сферы служит опорной шкалой длины для шкалы времени диффузии τ _R . Мы проводим стохастическое моделирование с использованием этих параметров с шагом по времени не более Δ t = τ _R /500.

Мы рассматриваем случай, когда акцептор и донор могут свободно вращаться, но удерживаются на фиксированном расстоянии R . Возьмем R = R ₀ , так что для идеального усреднения по всем конфигурациям ориентации эффективность передачи составляет E = 0,5. Рассмотрим динамику вращения относительно времени жизни возбуждения донора, характеризующуюся τ _D / τ _R .

Мы рассматриваем как быструю вращательную диффузию, где большинство конфигураций хорошо отбираются за время жизни донора τ _D / τ _R ≫ 1, так и медленную вращательную диффузию, где только очень ограниченное подмножество конфигураций отбираются за время жизни донора τ _D / τ _R ≪ 1. Для медленной вращательной диффузии мы обнаруживаем, что ограниченная выборка за время жизни донора может привести к значительным сдвигам наблюдаемого FRET переместите E в сторону более низкой эффективности, см. рис. 4.

Рис. 4. Вращательная диффузия и сдвиги в эффективности передачи FRET E .

Сверху вниз красители с уменьшающейся вращательной диффузией, имеющие характерные времена диффузии τ _R / τ _D = 19,5, 97,5, 195,0, 975. Средние значения эффективности в каждом случае соответственно равны E = 0,486, E = 0,456, E = 0,438 и E = 0,403. Сдвиг средней эффективности от самой медленной к самой быстрой рассмотренной диффузии составляет около 20%.Примечательной особенностью уменьшения коэффициента диффузии является расширение распределения наблюдаемых значений эффективности. Эталонный КПД E ₀ = 0,5 обозначен красной линией.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g004

Все конфигурации ориентации одинаково вероятны, и коэффициент κ ² линейно влияет на эффективность переноса в уравнении (3). Как следствие, проявленный сдвиг является результатом чисто кинетических эффектов.В частности, для наиболее быстрой вращательной диффузии донор и акцептор имеют больше возможностей занять ориентацию, благоприятную для передачи энергии. Другими словами, когда диффузия велика, донор и акцептор успевают диффундировать, чтобы встретить конфигурации, которые находятся в «зоне наилучшего восприятия», имеющей наибольшие шансы на запуск передачи энергии. Когда вращательная диффузия намного медленнее, чем время жизни донора, ориентация донора и акцептора остается близкой к начальной начальной конфигурации, которая в первую очередь определяет скорость передачи энергии.Это проявляется в сдвиге значений κ ² в сторону меньших значений, соответствующих менее эффективному переносу, когда вращательная диффузия медленная относительно срока службы донора, см. Рис. 5.

Рис. 5. Фактор ориентации во время переноса.

Показаны факторы κ ² , которые имели место при моделировании во время передачи энергии от донора к акцептору. Сравним случай медленной вращательной диффузии τ _D / τ _R = 0.001 и быстрая вращательная диффузия τ _D / τ _R = 0,05. Для медленной вращательной диффузии κ ² факторы демонстрируют значительный сдвиг в сторону меньших значений. Это следствие того, что быстрая вращательная диффузия дает больше возможностей быть в благоприятных ориентациях для передачи энергии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g005

Изменение эффективности переноса в результате кинетики вращения может быть значительным.Для относительно быстрой вращательной диффузии во временном масштабе τ _R / τ _D = 19,5, мы находим, что передача энергии составляет E = 0,486. Это близко к тому моменту, когда ориентация полностью усредняется, чтобы получить передачу энергии E = 0,5. Для шкалы времени медленной вращательной диффузии τ _R / τ _D = 975 мы имеем эффективность переноса E = 0.403. В этом случае кинетика вращения привела к сдвигу в средней эффективности переноса на 17%.

Наши результаты указывают на то, что эффективность передачи FRET E может демонстрировать значительный сдвиг без какого-либо изменения конформационного состояния измеряемой молекулы. Эти изменения возникают исключительно из-за разной скорости вращательной диффузии. На практике это может происходить из-за изменений вязкости окружающего растворителя или из-за переходных событий связывания с молекулами, присутствующими в растворителе, которые временно ограничивают вращение донора и акцептора.Мы показываем сдвиги, которые могут происходить из-за этих эффектов в широком диапазоне коэффициентов диффузии на рис. 6.

Рис. 6. Вращательная диффузия и сдвиги в эффективности передачи FRET E .

По мере того, как вращательная диффузия уменьшается, средняя эффективность переноса значительно меняется. На вставке мы показываем процентное смещение, измеренное как % смещение = | E _obs — E ₀ | / E ₀ где мы берем эталонный КПД E ₀ = 0.5. Первые несколько точек данных имеют τ _D / τ _R = 0,001, 0,003 и 0,005.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g006

3.3 Донорно-акцепторная диффузия на расстоянии

Мы рассматриваем роль относительной поступательной диффузии донорных и акцепторных молекул. Нас особенно интересует случай, когда измеряемое конформационное состояние молекулы включает выборку по ансамблю различных конфигураций.В этом случае донор и акцептор могут претерпевать значительную трансляционную диффузию за время жизни донора [51, 52]. Например, для неупорядоченного белка или полимера, подвергнутого различным условиям сольватации, FRET может использоваться для определения радиуса инерции [35, 53–55]. Когда ансамбль конфигураций остается неизменным, мы исследуем роль кинетики, связанной с диффузией расстояния разделения.

Мы моделируем диффузию разделительного расстояния R с помощью случайного процесса. (10) γ обозначает эффективное сопротивление, Φ потенциал свободной энергии для расстояния разделения R , D _S эффективный коэффициент диффузии при разделении и W _t броуновское движение.Уравнение следует интерпретировать в смысле исчисления Ито [48]. Мы моделируем разделение донорной и акцепторной меток, прикрепленных к полимеру, с помощью потенциала свободной энергии. (11) Мы параметризуем модель, используя коэффициент диффузии D _S и берем сопротивление γ = k _B T / D _S , где k _B — коэффициент Больцмана. постоянная и T — температура.Чтобы смоделировать, что происходит, когда расстояние разделения приближается к нулю, мы избегаем отрицательных длин с помощью отражающего граничного условия в нуле [49]. Мы характеризуем эту диффузионную динамику шкалой времени τ _S = ℓ ² / D _S , где ℓ — это та же длина, что и в уравнении (11). Параметры, используемые по умолчанию в нашем моделировании, приведены в Таблице 1.

В состоянии равновесия этот процесс диффузии имеет разделительное распределение (12) где — статистическая сумма [56].Для моделирования этого процесса мы генерируем временные шаги, используя метод Эйлера-Мараюмы [57]. (13) η ⁿ генерируется на каждом временном шаге как независимая стандартная гауссова случайная величина с нулевым средним и единицей дисперсии. Длительность временного шага обозначается как Δ t . На практике мы используем временной шаг с Δ t = τ _S /10 ⁴ . Чтобы дать некоторое представление о флуктуациях разделения и в качестве подтверждения наших методов моделирования, мы показываем численные результаты для равновесного распределения на рис.7.

Рис. 7. Равновесное распределение расстояний между донорами и акцепторами.

Результаты моделирования стадий акцепторно-донорных меток диффузии полимера (гистограмма) сравниваются с предсказанным распределением расстояний разделения из уравнения (12) (красная кривая). Результаты получены из 1,8 × 10 ⁶ выборочных шагов моделирования, соответствующих среднему значению μ = R ₀ и дисперсии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g007

Мы рассматриваем роль кинетики разделения донора и акцептора в течение времени жизни возбуждения донора. Мы рассматриваем эффективность переноса для различных скоростей разделения диффузии D _S относительно времени жизни донора τ _D . Это может быть охарактеризовано как τ _D / τ _S , где τ _S = ℓ ² / D _S .

Мы обнаружили, что уменьшение коэффициента диффузии разделения приводит к значительному сдвигу в эффективности переноса FRET, см. Рис. 8. Мы также обнаружили, что по мере уменьшения коэффициента диффузии разделения распределение наблюдаемых эффективностей значительно расширяется. Для самого быстрого трансляционного коэффициента диффузии у нас есть средняя эффективность передачи E = 0,723, для самого медленного рассматриваемого коэффициента трансляционной диффузии E = 0,508. Это дает относительный сдвиг в эффективности передачи FRET на 30%.

Рис. 8. Коэффициент диффузии разделения и эффективность переноса FRET.

Коэффициенты диффузии отрыва соответствуют τ _D / τ _S = 0,69, 0,07 и 0,007. У них средняя эффективность передачи соответственно E = 0,723, E = 0,553 и E = 0,508. Это соответствует относительному сдвигу на 30% в эффективности переноса. По мере уменьшения коэффициента диффузии разделения распределение эффективностей переноса значительно расширяется.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g008

Набор конфигураций одинаков как для самой быстрой, так и для самой медленной диффузии, поэтому изменение эффективности переноса происходит исключительно из-за кинетических эффектов. В течение времени жизни донора диффузия влияет на то, насколько вероятно, что донор и акцептор встретят конфигурации, благоприятные для передачи энергии. В случае медленной диффузии скорость передачи энергии в первую очередь определяется исходной конфигурацией донора и акцептора.

В случае быстрой диффузии относительно времени жизни донора, донор и акцептор имеют больше возможностей встретить благоприятные конфигурации для передачи энергии. Это различие в том, как часто встречаются такие «зоны наилучшего восприятия» для передачи энергии в течение срока службы донора, подтверждается наблюдаемыми разделительными расстояниями, которые возникают во время передачи энергии, см. Рис. 9.

Рис. 9. Расстояние разделения во время передачи энергии.

Показаны расстояния разделения, которые имели место при моделировании во время передачи энергии.Сравним случай медленной диффузии на расстояние τ _D / τ _S = 0,007 и быстрой диффузии на расстояние τ _D / τ _S = 0,69 . В случае быстрой диффузии мы видим, что передача энергии происходит гораздо чаще при меньших разделительных расстояниях.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g009

Для самого быстрого коэффициента диффузии мы видим, что значительно меньшие разделительные расстояния возникают во время передачи энергии и, таким образом, дают в среднем большую эффективность FRET.В случае самого медленного коэффициента диффузии мы видим, что распределение разделительных расстояний шире и более точно соответствует равновесному распределению разделительных расстояний, поскольку скорость передачи энергии в значительной степени определяется исходной конфигурацией донора и акцептора. Мы показываем сдвиги в передаче энергии для широкого диапазона коэффициентов диффузии разделения на рис. 10.

Рис. 10. Распространение расстояний и сдвиги в эффективности передачи FRET.

По мере того, как расстояние диффузии уменьшается, средняя эффективность переноса значительно меняется.На вставке мы показываем сдвиг как относительный процент, равный % сдвиг = | E _obs — E ₀ | / E ₀ с эталонной эффективностью E ₀ = 0,5.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g010

3.4 Роль неизлучающего тушения

Мы также рассматриваем случай, когда донор может снять возбуждение через неизлучающий путь [29]. Одним из возможных механизмов является динамическое тушение, когда донор высвобождается, вступая в контакт с химическими частицами, диффундирующими в окружающем растворе [26–28].У некоторых доноров есть фотофизика, на которую существенно влияет присутствие ионов. Это используется в некоторых экспериментах в качестве репортера концентрации ионов [15, 26, 31].

Мы принимаем эти эффекты во внимание, развивая некоторую теорию того, как дополнительный неизлучающий путь может изменить наблюдаемую эффективность FRET. Неизлучающий путь гашения можно смоделировать в нашей кинетике, убивая некоторую часть событий девозбуждения донора, которые привели бы к передаче энергии акцептору и, в конечном итоге, испусканию акцепторных фотонов.Для эффективности передачи FRET это соответствует увеличению уравнения (5) до (14) Величина 1 — α дает долю девозбуждений доноров, которые приводят к тому или иному типу события тушения без излучения. Дает соответствующую смещенную эффективность FRET при включении пути тушения.

Случай α = 1 соответствует ситуации, когда не излучающих тушащих событий не происходит. В этом случае у нас есть. В случае α = 0 все наблюдаемые девозбуждения приводят к не излучающим тушащим событиям вместо девозбуждения донора посредством событий передачи FRET и испускания акцепторных фотонов.В этом случае мы имеем, см. Рис 11.

Рис. 11. Тушение без излучения и сдвиги в эффективности передачи FRET.

Наблюдаемая эффективность переноса FRET показана при включении дополнительного неизлучающего пути в донорно-акцепторную кинетику. Для различных скоростей α неизлучающих событий гашения результаты показывают, как повышается эталонная эффективность передачи E в случае отсутствия гашения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g011

Эффективность FRET можно удобно выразить как (15) куда . Это обеспечивает эталонный показатель f , соответствующий отношению эмиссии донора к эмиссии акцептора, когда нет неизлучающего тушения. Эталонная фракция f связана с эталонной эффективностью передачи FRET E как f = E ^-1 -1. Сдвиг в процентах наблюдаемой эффективности FRET, возникающий в результате гашения, определяется выражением (16) Мы видим, что процентное изменение FRET, которое происходит из-за гашения, зависит от эталонной эффективности передачи FRET E .Фактически, возникающий сдвиг становится все более чувствительным по мере уменьшения E , см. Рис. 12.

Рис. 12. Тушение без излучения и сдвиги в эффективности передачи FRET.

Относительный процент сдвига эффективности переноса показан, когда тушение без излучения происходит как часть донорно-акцепторной кинетики.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177122.g012

4 Обсуждение

Мы показали несколько различных способов, с помощью которых эффективность FRET может быть изменена как следствие кинетических эффектов, в то время как лежащее в основе молекулярное конформационное состояние фактически осталось прежним.Мы рассматриваем, как такие кинетические механизмы связаны с некоторыми недавними экспериментами, изучающими причины сдвигов в эффективности FRET [19, 34, 35, 58].

FRET часто используется для измерения конформационных изменений или фолдинга белков, поскольку денатурирующие условия меняются [22, 35, 53]. В недавней работе Липмана, Плакско и др. [35] радиус вращения полимеров полиэтиленгликоля (ПЭГ) рассматривается в условиях сольватации, которые дают случайные спирали. В отличие от белков, не ожидается, что ансамбль конфигураций полимера PEG существенно изменится при изменении денатуранта.Это подтверждается экспериментами по измерениям рассеяния рентгеновских лучей, которые действительно показывают, что радиус вращения ПЭГ остается неизменным при изменении денатуранта [35, 58]. Это обеспечивает полезный контроль для исследования FRET, поскольку условия денатуранта меняются.

Интересным открытием является то, что измерения FRET в одних и тех же условиях показывают значительный сдвиг в измеренной эффективности передачи. Для полимера PEG 3 кДа в денатуранте GuHcl в диапазоне концентраций от 0 до 6 М молярный сдвиг наблюдался в эффективности переноса примерно на 20%, как указано в E ₀ = 0.5. Для того же полимера в денатуранте , мочевина в диапазоне концентраций от 0 до 8M наблюдали сдвиг в эффективности на ~ 24% по ссылке из E ₀ = 0,5. Подобные сдвиги были обнаружены для экспериментов, проведенных с использованием 5 кДа ПЭГ [35].

Наши результаты показывают, что значительные сдвиги могут происходить в наблюдаемой эффективности FRET, даже когда нет никаких основных изменений в конформационном ансамбле. Мы показали, как эффективность переноса может изменяться исключительно из-за кинетических эффектов, возникающих из-за изменения скорости диффузии ориентации акцептор-донор, диффузии расстояния между донором и акцептором, а также из-за неизлучающего тушения.Для диффузии расстояния разделения донор-акцептор мы обнаружили, что такие кинетические эффекты могут вызывать сдвиги в эффективности до 48%. Это произошло, когда шкала времени диффузии на расстоянии приблизилась к шкале времени жизни донора, см. Рис. 10.

Один из способов объяснить экспериментально наблюдаемые сдвиги — рассмотреть, как денатурирующий агент увеличивает вязкость растворителя [35, 59]. Ожидается, что изменения вязкости растворителя будут тесно связаны с изменениями скорости диффузии, как предполагает соотношение Стокса-Эйнштейна [49].Такой механизм теоретически исследован в работах [58, 60]. Мы обсуждаем здесь, как результаты нашего моделирования соотносятся с изменениями вязкости растворителя.

Предполагаемое изменение объемной вязкости растворителя при изменении концентрации денатуранта мочевины при 8M составляет 1,66, а для GuHcl 6M коэффициент 1,61 согласно экспериментам [59]. Чтобы связать вязкость с коэффициентом диффузии, можно использовать соотношение Стокса-Эйнштейна D = k _B T / γ .Сопротивление определяется как γ = 6 πμa , где μ — вязкость растворителя, а a — эталонная шкала длины, характеризующая размер диффундирующей молекулы. Это говорит о том, что увеличение вязкости растворителя в 1,61 раза снижает коэффициент диффузии в 0,6 раза.

В наших расчетах, взяв за основу τ _D / τ _S = 0,1, такое изменение вязкости приводит к сдвигу эффективности переноса на ∼12%.Этот вклад, обусловленный исключительно диффузионной кинетикой разделения донора и акцептора, составляет примерно половину сдвига ∼24%, наблюдаемого для мочевины 8M , и ∼20%, наблюдаемого для 6M GuHcl в [35]. Это согласуется с выводами [58], предполагающими, что другие механизмы также могут играть роль в наблюдаемом изменении эффективности переноса.

При интерпретации этих эффектов существует ряд потенциальных тонкостей. С одной стороны, донорные и акцепторные молекулы сравнимы по размеру с молекулами, денатурирующими вязкость, и изменения коэффициента диффузии, возможно, могут быть более значительными из-за более сложных взаимодействий, чем предполагалось при использовании простой объемной теории вязкости и диффузии [61–63].Другое соображение — это роль неизлучающего тушения, вызванного столкновительным контактом молекул денатуранта с донором [29]. В сочетании с кинетическими изменениями диффузии даже небольшое количество возбуждений, приводящее к тушению <5%, привело бы к общему комбинированному сдвигу на ~ 20% в наблюдаемой эффективности переноса, см. Рис. 12.

5 Заключение

Мы показали, что кинетика может играть значительную роль в изменении наблюдаемой эффективности переноса FRET, даже если нет основного изменения в конформационном состоянии измеряемой молекулы.Мы обнаружили, что изменение ориентации диффузии может в самых крайних случаях изменить эффективность переноса до 20%. Для рассматриваемой диффузии расстояние разделения донор-акцептор мы обнаружили в самых крайних случаях сдвиги до 48%. Наши данные о расстоянии донор-акцептор согласуются с исследованиями Макарова и Плакско [38]. Отметим, что наши результаты, касающиеся ориентационной диффузии, учитывают дополнительные эффекты, которых нет в [38], и могут предложить некоторое объяснение сдвигов FRET, которые наблюдаются в жестких полипролиновых цепях [34, 35].Мы обнаружили, что диффузионная кинетика как ориентации, так и разделения демонстрирует отчетливую подпись на гистограмме наблюдаемой эффективности переноса в виде уширения пиков. Мы также обнаружили, что неизлучающие тушения, которые происходят даже на умеренном уровне, могут привести к значительным сдвигам в наблюдаемой эффективности переноса. Обсуждаемые нами механизмы имеют потенциально важные последствия при интерпретации измерений FRET, особенно в отношении выводов из изменений расстояния FRET и того, как это связано с изменениями конформационного состояния молекул.При анализе измерений FRET мы надеемся, что наши результаты предоставят несколько полезных ориентиров, которые помогут определить значимость наблюдаемых сдвигов и роль кинетических эффектов.

Благодарности

Авторы P.J.A и B.W благодарят за поддержку исследовательского гранта NSF CAREER — 0956210, NSF DMS — 1616353 и DOE ASCR CM4 DESC0009254. Авторы также хотели бы поблагодарить А. Саймона, Э. Липмана и К. Плакско за полезные обсуждения и предложения. Признавая вышеперечисленное, авторы берут на себя полную ответственность за содержание и комментарии в рукописи.

Вклад авторов

1. Концептуализация: PJA BW.
2. Расследование: PJA BW.
3. Методология: PJA BW.
4. Написание — первоначальный черновик: PJA BW.
5. Написание — просмотр и редактирование: PJA BW.

Список литературы

1. 1. Forster TH. Механизмы передачи энергии электронного возбуждения. Дополнение к радиационным исследованиям. 1960; 2: 326–339.
2. 2. Clegg RM. История FRET: от зачатия до родов. В: CD G, JR L, редакторы. Обзоры в Флуоресценции. т. 3. Springer; 2006. с. 1–45.
3. 3. Форстер Т. 10-я лекция в память о Спайерсе. Механизмы передачи электронного возбуждения. Обсудите Faraday Soc. 1959; 27 (0): 7–17.
4. 4. Страйер Л., Хаугланд Р.П. Передача энергии: спектроскопическая линейка. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1967. 58 (2): 719–726. pmid: 5233469
5. 5. ван дер Меер Б.В. Теория Форстера. В: Мединц I, Хильдебрандт Н., редакторы. FRET — резонансный перенос энергии Форстера: от теории к приложениям. 1-е изд. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA .; 2014. с. 23–62.
6. 6. Вайс С. Флуоресцентная спектроскопия одиночных биомолекул. Наука. 1999. 283 (5408): 1676–1683. pmid: 10073925
7. 7. Сонг Й., Мадахар В., Ляо Дж. Развитие FRET-анализа в платформы количественной и высокопроизводительной технологии скрининга белок-белковых взаимодействий.Анналы биомедицинской инженерии. 2011. 39 (4): 1224–1234. pmid: 21174150
8. 8. Plaxco KW, Soh HT. Биосенсоры на основе переключателей: новый подход к молекулярному обнаружению in vivo в реальном времени. Тенденции в биотехнологии. 2011; 29 (1): 1–5. pmid: 21106266
9. 9. Хаас Э., Качальски-Кацир Э., Стейнберг И.З. Броуновское движение концов олигопептидных цепей в растворе, оцениваемое по передаче энергии между концами цепи. Биополимеры. 1978. 17 (1): 11–31.
10. 10.Рахман ММ. Введение в перенос энергии резонанса флуоресценции (FRET). Научный журнал физики. 2012 ;.
11. 11. Назаров П.В., Кохорст РБМ, Вос В.Л., Апанасович В.В., Хемминга М.А. Исследование FRET мембранных белков: подгонка на основе моделирования для анализа внедрения и ассоциации мембранных белков. Биофизический журнал. 2006. 91 (2): 454–466. pmid: 16632512
12. 12. Поршень DW, Kremers GJ. Флуоресцентный белок FRET: хорошее, плохое и уродливое.Направления биохимических наук. 2007. 32 (9): 407–414. pmid: 17764955
13. 13. Агафонов Р.В., Неграшов И.В., Ткачев Ю.В., Блейкли С.Е., Титус М.А., Томас Д.Д. и др. Структурная динамика спирали реле миозина по данным EPR и FRET с временным разрешением. Труды Национальной академии наук. 2009. 106 (51): 21625–21630.
14. 14. Эдидин М. Флуоресцентный резонансный перенос энергии: методы измерения молекулярной конформации и молекулярной близости. В: Текущие протоколы в иммунологии.John Wiley & Sons, Inc.; 2001. с. -. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1002/0471142735.im1810s52.
15. 15. Ueda Y, Kwok S, Hayashi Y. Применение зондов FRET в анализе нейрональной пластичности. Границы в нейронных цепях. 2013; 7: 163–. pmid: 24133415
16. 16. Ха Т, Тинг А.Ю., Лян Дж., Колдуэлл В.Б., Дениз А.А., Chemla DS и др. Одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия конформационной динамики и механизма расщепления ферментов. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1998. 96 (3): 893–898.
17. 17. Шреста Д., Дженей А., Надь П., Вереб Г., Сёллёси Дж. Понимание FRET как исследовательского инструмента для исследований сотовой связи. Международный журнал молекулярных наук. 2015. 16 (4): 6718–6756. pmid: 25815593
18. 18. Дениз А.А., Дахан М., Грюнвелл JR, Ха Т, Фаулхабер А.Е., Chemla DS и др. Однопарный резонансный перенос энергии флуоресценции на свободно диффундирующих молекулах: наблюдение зависимости Фёрстера от расстояния и субпопуляций. Труды Национальной академии наук.1999. 96 (7): 3670–3675.
19. 19. Вайс С. Измерение конформационной динамики биомолекул с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул. Nat Struct Mol Biol. 2000. 7 (9): 724–729.
20. 20. Вентилятор C, Plaxco KW, Heeger AJ. Биосенсоры на основе донорно-акцепторных расстояний, модулируемых связыванием. Тенденции в биотехнологии. 2005. 23 (4): 186–192. pmid: 15780710
21. 21. Ни Q, Чжан Дж. Динамическая визуализация сотовой передачи сигналов. В: Эндо И., Нагамуне Т., редакторы.Нано / микробиотехнологии. Берлин, Гейдельберг: Springer Berlin Heidelberg; 2010. с. 79–97. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1007/10_2008_48.
22. 22. Шулер Б., Липман Э.А., Итон Вашингтон. Исследование поверхности свободной энергии для сворачивания белков с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул. Природа. 2002; 419 (6908): 743–747. pmid: 12384704
23. 23. Hofmann H, Hillger F, Pfeil SH, Hoffmann A, Streich D, Haenni D и др. Одномолекулярная спектроскопия сворачивания белка в шаперониновой клетке.Труды Национальной академии наук. 2010. 107 (26): 11793–11798.
24. 24. Wickersham CE, Cash KJ, Pfeil SH, Bruck I, Kaplan DL, Plaxco KW и др. Отслеживание молекулярного мотора с помощью наномасштабного оптического кодировщика. Nano Lett. 2010. 10 (3): 1022–1027. pmid: 20121107
25. 25. Мори Т., Вале Р.Д., Томишиге М. Как кинезин ждет между шагами. Природа. 2007. 450 (7170): 750–754. pmid: 18004302
26. 26. Лю Б., Цзэн Ф., Ву Г., Ву С. Наночастицы как каркас для основанного на FRET ратиометрического обнаружения ионов ртути в воде с квантовыми точками в качестве доноров.Аналитик. 2012. 137 (16): 3717–3724. pmid: 22737682
27. 27. Ли Х., Рен Х, Инь Л., Баласубраманиан С., Кленерман Д. Измерение динамики одиночных молекул нуклеиновых кислот в растворе с помощью двухцветной фильтрованной ратиометрической флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2004. 101 (40): 14425–14430. pmid: 15452356
28. 28. Marras SAE, Kramer FR, Tyagi S. Эффективность резонансного переноса энергии флуоресценции и контактно-опосредованного тушения в олигонуклеотидных зондах.Исследования нуклеиновых кислот. 2002; 30 (21): e122 – e122. pmid: 12409481
29. 29. Чанг Х.С., Луи Дж. М., Итон, Вашингтон. Различие между динамикой белка и фотофизикой красителя в экспериментах с одномолекулярным FRET. Биофизический журнал. 2009. 98 (4): 696–706.
30. 30. Стейнберг И.З., Качальски Э. Теоретический анализ роли диффузии в химических реакциях, тушении флуоресценции и безызлучательной передаче энергии. Журнал химической физики. 1968. 48 (6): 2404–2410.
31. 31. Дин KM, Qin Y, Palmer AE. Визуализация ионов металлов в клетках: обзор аналитических методов, подходов и зондов. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Исследование молекулярных клеток. 2012; 1823 (9): 1406–1415.
32. 32. Ha T, Enderle T, Ogletree DF, Chemla DS, Selvin PR, Weiss S. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача резонансной энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.1996. 93 (13): 6264–6268. pmid: 86
33. 33. Нат А., Саммалкорпи М., ДеВитт Д., Трекслер А., Эльбаум-Гарфинкль С., О’Херн С. и др. Конформационные ансамбли альфа-синуклеина и тау-белка: сочетание одномолекулярного FRET и моделирования. Биофизический журнал. 2012; 103 (9): 1940–1949. pmid: 23199922
34. 34. Schuler B, Lipman EA, Steinbach PJ, Kumke M, Eaton WA. Полипролин и «спектроскопическая линейка» заново с флуоресценцией одиночных молекул. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.2005. 102 (8): 2754–2759. pmid: 15699337
35. 35. Уоткинс Х.М., Саймон А.Дж., Сосник Т.Р., Липман Э.А., Хьелм Р.П., Плакско К.В. Отрицательный контроль с произвольной катушкой воспроизводит несоответствие между измерениями рассеяния и FRET размеров денатурированного белка. Труды Национальной академии наук. 2015; 112 (21): 6631–6636.
36. 36. Лакович JR, Kuśba J, Shen Y, Malicka J, D’Auria S, Gryczynski Z, et al. Влияние металлических частиц серебра на резонансную передачу энергии между флуорофорами, связанными с ДНК.Журнал флуоресценции. 2003. 13 (1): 69–77.
37. 37. Чжан Дж., Фу Й., Лакович-младший. Улучшенная передача энергии резонанса Фёрстера (FRET) на отдельной металлической частице. Журнал физической химии C. 2007; 111 (1): 50–56.
38. 38. Макаров Д.Е., Plaxco KW. Измерение расстояний внутри развернутых биополимеров с использованием резонансной передачи энергии флуоресценции: влияние динамики полимерных цепей на наблюдаемую эффективность резонансной передачи энергии флуоресценции. Журнал химической физики.2009; 131 (8).
39. 39. Камли Б.А., Браун FLH, Липман Е.А. Перенос Фёрстера за предел слабого возбуждения. Журнал химической физики. 2009; 131 (10).
40. 40. Муньос-Лоса А., Крутчет С., Крюгер Б. П., Харселл Л. Р., Меннуччи Б. Беспокойство по поводу FRET: отказ идеального дипольного приближения. Биофизический журнал. 2009. 96 (12): 4779–4788.
41. 41. ван дер Меер Б.В. Теория Форстера. В: Мединц I, Хильдебрандт Н., редакторы. Оптимизация коэффициента ориентации по каппа-квадрату для более точных измерений FRET в FRET — резонансная передача энергии Форстера: от теории к приложениям.1-е изд. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA .; 2014. с. 63–104.
42. 42. Эндрюс Д.Л., Демидов А.А. Глава 14: Теоретические основы и разработка приложений. В кн .: Передача энергии резонанса. В то время как 2009. с. 461–499.
43. 43. Саху Х. Ферстер резонансный перенос энергии — Спектроскопический нанополимер: принцип и приложения. Журнал фотохимии и фотобиологии C: обзоры фотохимии. 2011; 12 (1): 20–30.
44. 44. Валчевска-Шевц К., Корри Б.Учет диффузии и ориентации красителя при связывании измерений FRET с расстояниями: три простых вычислительных метода. Phys Chem Chem Phys. 2014. 16 (24): 12317–12326. pmid: 24824374
45. 45. Икбал А., Арслан С., Окумус Б., Уилсон Т.Дж., Жиро Г., Норман Д.Г. и др. Зависимость от ориентации в переносе флуоресцентной энергии между Cy3 и Cy5, концевыми присоединенными к двухцепочечным нуклеиновым кислотам. Труды Национальной академии наук. 2008. 105 (32): 11176–11181.
46. 46.Клозе Д., Клар Дж. П., Громанн Д., Кей К.В.М, Вернер Ф., Штайнхофф Х.Дж. Моделирование и реальность: сравнение прогнозов расстояния In Silico с измерениями DEER и FRET. PLoS ONE. 2012; 7 (6): e39492–. pmid: 22761805
47. 47. Brillinger DR. Частица, случайно перемещающаяся по сфере. Журнал теоретической вероятности. 1997. 10 (2): 429–443.
48. 48. Оксендал Б. Стохастические дифференциальные уравнения: Введение. Springer; 2000.
49. 49. Гардинер CW.Справочник по стохастическим методам. Серия по синергетике. Springer; 1985.
50. 50. Сигурдссон Дж. К., Атцбергер П. Дж. Гидродинамическое связывание включений частиц, встроенных в изогнутые двухслойные липидные мембраны. Мягкая материя. 2016; 12 (32): 6685–6707. pmid: 27373277
51. 51. Гурунатан К., Левитус М. Флуктуационная спектроскопия FRET диффундирующих биополимеров: вклад конформационной динамики и поступательной диффузии. J. Phys Chem B. 2010; 114 (2): 980–986. pmid: 20030305
52. 52.Бадали Д., Градинару СС. Влияние броуновского движения флуоресцентных зондов на измерение наноразмерных расстояний с помощью резонансной передачи энергии Фёрстера. Журнал химической физики. 2011; 134 (22): 225102. pmid: 21682537
53. 53. Торговец KA, Best RB, Louis JM, Gopich IV, Eaton WA. Характеристика развернутых состояний белков с помощью FRET-спектроскопии одиночных молекул и молекулярного моделирования. Труды Национальной академии наук. 2007. 104 (5): 1528–1533.
54. 54.Хаас Э. Ансамблевые методы FRET в исследованиях белков с внутренними нарушениями. В кн .: Уверский Н.В., Дункер К.А., ред. Анализ внутренне нарушенных белков: том 1, методы и экспериментальные инструменты. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press; 2012. с. 467–498. Доступно по ссылке: http://dx.doi.org/10.1007/978-1-61779-927-3_28.
55. 55. Шулер Б., Мюллер-Шпет С., Соранно А., Неттелс Д. Применение конфокального одномолекулярного FRET к внутренне неупорядоченным белкам. В кн .: Уверский Н.В., Дункер К.А., ред.Анализ внутренне нарушенных белков: том 2, методы и экспериментальные инструменты. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Springer Нью-Йорк; 2012. с. 21–45. Доступно по ссылке: http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4614-3704-8_2.
56. 56. Reichl LE. Современный курс статистической физики. Jon Wiley and Sons Inc .; 1997.
57. 57. Э. КП, Платен Э. Численное решение стохастических дифференциальных уравнений. Springer-Verlag; 1992.
58. 58. Ю Т.Ю., Мейсбергер С., Хиншоу Дж., Поллак Л., Харан Дж., Сосник Т.Р. и др.Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и FRET-спектроскопия одиночных молекул дают сильно различающиеся представления о низкоденатурантном развернутом состоянии. Журнал молекулярной биологии. 2012. 418 (3-4): 226–236. pmid: 22306460
59. 59. Кавахара К., Танфорд С. Вязкость и плотность водных растворов мочевины и гидрохлорида гуанидина. Журнал биологической химии. 1966. 241 (13): 3228–3232. pmid: 5

    6

60. 60. Мурацугу А., Ватанабе Дж., Киношита С. Влияние диффузии на резонансный перенос энергии Фёрстера в маловязком растворе.Журнал химической физики. 2014; 140 (21): 214508. pmid: 24
    7
61. 61. Ли З. Критический размер частиц, при котором соотношение Стокса-Эйнштейна нарушается. Phys Rev E. 2009; 80 (6): 061204–.
62. 62. Шарма М., Яшонат С. Нарушение связи Стокса – Эйнштейна: роль взаимодействий в размерной зависимости самодиффузии. J. Phys Chem B. 2006; 110 (34): 17207–17211. pmid: 169
63. 63. Бернштейн Дж., Фрикс Дж. Анализ диффузии отдельных частиц с временным связыванием с использованием фильтрации частиц.Журнал теоретической биологии. 2016; 401: 109–121. pmid: 27107737

Схема передачи энергии в FRET. (A) Донор и акцептор …

Контекст 1

… требует, чтобы флуорофоры донора и акцептора находились на расстоянии $ 10 нм (100 ангстрем) [4]. Если донорный и акцепторный флуорофоры расположены на белке на расстоянии более 10 нм друг от друга, возбуждение донора не будет передавать достаточно энергии и возбуждать акцептор. Однако, если донорные и акцепторные флуорофоры находятся в непосредственной близости внутри белка, FRET будет обнаружен для внутримолекулярного структурного анализа (рис.2А). Спектральное перекрытие, которое происходит во время передачи энергии FRET от донорного флуорофора, FlAsH, к акцепторному флуорофору, Alexa 568, было визуализировано по спектрам флуоресценции одинарной (FlAsH или Alexa 568) и двойной (FlAsH и Alexa 568) белок, как показано на рис. …

Контекст 2

… требует, чтобы донорные и акцепторные флуорофоры находились на расстоянии $ 10 нм (100 ангстрем) [4]. Если донорный и акцепторный флуорофоры расположены на белке на расстоянии более 10 нм друг от друга, возбуждение донора не будет передавать достаточно энергии и возбуждать акцептор.Однако, если донорные и акцепторные флуорофоры находятся в непосредственной близости в пределах белка, FRET будет обнаружен для внутримолекулярного структурного анализа (рис. 2А). Спектральное перекрытие, которое происходит во время передачи энергии FRET от донорного флуорофора, FlAsH, к акцепторному флуорофору, Alexa 568, было визуализировано с помощью спектров флуоресценции одинарной (FlAsH или Alexa 568) и двойной (FlAsH и Alexa 568) белок, как показано на рис. …

Контекст 3

… (100 ангстрем) расстояние [4]. Если донорный и акцепторный флуорофоры расположены на белке на расстоянии более 10 нм друг от друга, возбуждение донора не будет передавать достаточно энергии и возбуждать акцептор. Однако, если донорные и акцепторные флуорофоры находятся в непосредственной близости в пределах белка, FRET будет обнаружен для внутримолекулярного структурного анализа (рис. 2А). Спектральное перекрытие, которое происходит во время передачи энергии FRET от донорного флуорофора, FlAsH, к акцепторному флуорофору, Alexa 568, было визуализировано по спектрам флуоресценции одинарного (FlAsH или Alexa 568) и двойного (FlAsH и Alexa 568) белка как представленный на рис….

Контекст 4

… будет обнаружен для внутримолекулярного структурного анализа (рис. 2A). Спектральное перекрытие, которое происходит во время передачи энергии FRET от донорного флуорофора, FlAsH, к акцепторному флуорофору, Alexa 568, было визуализировано по спектрам флуоресценции одинарного (FlAsH или Alexa 568) и двойного (FlAsH и Alexa 568) белка как представлены на рис. …

Гибкий подход к оценке функций затухания флуоресценции в сложных системах передачи энергии | BMC Biophysics

Выбор красителей

Сначала мы выбрали набор красителей для оптимальной согласованности смоделированных и экспериментальных гистограмм донорского TCSPC и для отражения ожидаемого поведения при моделировании.Обратите внимание, что этот подход позволяет также рассчитывать гистограммы акцепторного TCSPC; здесь, если не указано иное, мы ориентируемся в первую очередь на гистограммы донорского TCSPC. Обычно радиус Ферстера пары FRET следует выбирать в пределах диапазона расстояний, которые ожидаются между донором и его ближайшим соседним акцептором, по следующим причинам. Во-первых, эффективность FRET и измеренные гистограммы донорского TCSPC чувствительно реагируют на расстояния в диапазоне от половины до двух радиусов Ферстера, тем самым увеличивая влияние небольших отклонений между расстояниями.Для расстояний, превышающих удвоенный радиус Ферстера, скорости FRET чрезвычайно низкие и очень мало влияют на зависящую от времени вероятность испускания фотонов. Передача энергии на расстояния, близкие к половине радиуса Ферстера, чрезвычайно эффективна, но вряд ли какие-либо донорные фотоны будут собраны. Как правило, эти расстояния не влияют на распределение донорных фотонов, поскольку доноры с очень высокими скоростями тушения имеют пренебрежимо малую яркость по сравнению с донорами без акцепторов на расстояниях ближе, чем половина радиуса Ферстера.Кроме того, поскольку в пределах половины радиуса Ферстера перенос донора к акцептору происходит почти мгновенно, никаких значительных изменений в донорном TCSPC (или даже в акцепторном TCSPC) не ожидается. Во-вторых, фактор, описывающий взаимную ориентацию диполей перехода донорного излучения и поглощения акцептора ( κ ² ) обычно принимается равным 2/3, что основано на предположении, что красители имеют достаточно времени, чтобы рандомизировать свою ориентацию в течение времени, пока донор остается возбужденным [1].Укорочение времени затухания флуоресценции путем введения акцепторов на гораздо более близком расстоянии, чем половина радиуса Ферстера, дает это предположение примерно κ ² неточно. В-третьих, слишком большое количество коротких расстояний резко увеличивает время моделирования за счет уменьшения количества собранных фотонов из-за большой конкуренции за дезактивацию переноса доноров. Кроме того, время затухания флуоресценции донора должно быть достаточно большим во время измерений, чтобы предоставить донорам достаточно времени для рандомизации своей ориентации после возбуждения и ограничения доли фотонов, обнаруживаемых неслучайным распределением углов испускания фотонов в начале обнаружение сигнала.

Возможность гомо-FRET добавляет еще один аспект, который следует учитывать при выборе красителей. Обычно гомо-FRET уменьшает время, необходимое для рандомизации ориентации возбужденных красителей, и вносит случайность в направление излучения дипольного момента перехода донора. Кроме того, гомо-FRET изменяет положение возбужденного донора, которое обычно фиксируется при моделировании. Правильный выбор красителя сделает этот эффект незначительным. Стоксов сдвиг должен быть достаточно большим, чтобы минимизировать количество гомо-FRET при измерении времени затухания флуоресценции.Эффекты передачи возбужденных состояний между двумя соседними донорами в любом направлении не обязательно компенсируют друг друга. Следовательно, перекрытие спектров поглощения и излучения донора должно быть минимальным, чтобы ограничить передачи донор-донор расстояниями, близкими к нулю, на которых оба донора будут иметь почти одинаковое окружение.

Здесь мы использовали Alexa 488 и Alexa 594 (технологии Life). Красители были выбраны потому, что они соответствуют описанным требованиям и критериям для подходящих экспериментальных установок, например.грамм. высокая фотостабильность, коэффициент экстинкции и квантовый выход [21,22].

Генерация входных файлов

Для считывания информации о позициях, служащих точкой привязки в код, входные файлы создаются по следующей схеме. Файлы содержат три декартовых координаты, которые определяют размеры моделируемого объема, три двоичных значения, определяющих периодичность системы в каждом направлении, а также количество и декартовы координаты доноров и акцепторов в системе.Все координаты даны в нанометрах.

Мы случайным образом расположили наши красители в соответствии с вероятностями, полученными из (i) определенных концентраций красителя со случайным распределением красителей в трехмерном пространстве, или (ii) фиксированных меченых структур с известными сайтами мечения в соответствии с вероятностями мечения донорами или акцепторами. . Кроме того, были созданы файлы с определенными расстояниями донор-акцептор в определенных соотношениях для сравнения моделирования с теоретически рассчитанным поведением времени затухания флуоресценции.

Расчет скоростей FRET

При моделировании возможных процессов дезактивации для каждого донора учитываются все акцепторы, которые могут оказаться ближе, чем в два раза радиуса Ферстера, учитывая также длину линкеров красителя. Расстояния х , ставки FRET х _т и вероятности деактивации P Дезактивация затем рассчитываются для каждого донора (рис. 1, этап 1).6 $$

(1)

где τ _{D, 0} — время жизни донора в отсутствие акцептора и R ₀ — характерный радиус Фёрстера, при котором половина дезактивации электронно-возбужденных донорных состояний происходит за счет передачи энергии акцептору.

$$ {P} _ {деактивация} = 1- \ exp \ left (- {\ displaystyle {\ sum} _i {k} _i} \ times \ varDelta t \ right) $$

(2)

где k _и обозначает индивидуальные скорости дезактивации для этого конкретного донора посредством испускания фотонов, FRET или других процессов дезактивации, а Δ t — длина временного интервала.Периодичность объема учитывается для правильного определения среды каждого донора. [Дополнительную информацию см. В дополнительном файле 1.]

Расстояния линкера можно выбрать для донора и акцептора индивидуально. При моделировании положение красителей изменяется от координат места маркировки, указанных во входном файле, на это расстояние в случайном направлении (рис. 1, шаг 4). Предполагается, что в течение одного цикла возбуждения положения красителя постоянны.Однако между двумя событиями возбуждения все красители перемещаются в объеме, который ограничен линкером, независимо от их последнего назначенного положения. Обратите внимание, что это приводит к довольно сложному распределению расстояний между красителями, что приводит к неэкономичному времени вычислений для аналитических решений. Короткое расстояние линкера минимизирует ошибки из-за неслучайной ориентации линкера и упрощения распределения расстояния красителя до его исходных координат. Напротив, более крупные линкерные последовательности допускают большие неточности в предсказанном распределении положений красителя.Однако серьезным нарушением предполагаемых условий было бы ограничение случайности ориентации красителя или его поворотной гибкости. Это могло быть связано с очень короткой или очень жесткой линкерной последовательностью. Ограниченная гибкость вращения красителя приведет к ложным предсказаниям κ ² значений и, по крайней мере, на ранних временных шагах, зависящую от времени вероятность обнаружения излучаемых фотонов при выбранном угле обнаружения. Мы рекомендуем обеспечить разумную гибкость красителя, подтвердив рандомизацию красителя измерениями анизотропии [20].В качестве альтернативы, с помощью ограниченной подвижности краситель-диполь следует проводить точное моделирование молекулярной динамики (МД) для получения точного распределения относительных углов в каждой системе индивидуально [16]. Обратите внимание, что моделирование MD может потребовать исключительной вычислительной мощности и, следовательно, может быть неприменимо в сложных системах.

Программа моделирования

После того, как каждый необходимый параметр считан или рассчитан, экспериментальная процедура моделируется (рис. 1, этап 2-11). Случайное подмножество доноров выбирается путем присвоения случайных чисел каждому донору и возбуждается в фиксированный нулевой момент времени, предполагая бесконечно короткий световой импульс для возбуждения (рисунок 1, шаг 3).Чтобы принять во внимание хронологию событий, каждый временной шаг, наблюдаемый в эксперименте, моделируется для всех красителей (рис. 1, этап 6-11). После моделирования в течение времени, равного всему экспериментально контролируемому времени, или когда в цикле возбуждения не осталось возбужденного донора, схема замыкается. Необязательно, временная зависимость дезактивации акцептора также моделируется на всем временном интервале. Циклы возбуждения повторяются до тех пор, пока за один временной интервал не будет достигнуто пороговое значение количества фотонов, которое устанавливается пользователем и необходимо для сбора надлежащей статистики (Рисунок 1, Шаг 2).В течение каждого временного шага заданного цикла возбуждения доноры и акцепторы контролируются в заданном порядке (рисунок 1).

Деактивация акцептора

Чтобы акцепторы, которые уже получили квант энергии, стали доступными для новых событий FRET, мы назначаем случайную вероятность каждому электронно возбужденному акцептору с помощью генератора случайных чисел (рисунок 1, шаг 6). Если она ниже, чем вероятность дезактивации в течение временного шага моделирования, акцептор снова доступен для передачи энергии по аналогии с формулой.2, где время жизни акцептора является обратной суммой процессов дезактивации. Количество событий деактивации акцепторов суммируется для каждого временного интервала.

Циклы возбуждения донора

Каждому донору в системе присваивается случайное значение с помощью генератора случайных чисел. Доноры со случайными значениями ниже вероятности возбуждения возбуждаются. Мы ускорили моделирование, убедившись, что в каждом цикле возбуждения возбужден хотя бы один донор. Возбужденные доноры впоследствии упорядочиваются по их случайно назначенному значению, от наименьшего к наибольшему, и в данном цикле возбуждения моделируются в таком порядке, чтобы избежать возможного смещения из-за фиксированного порядка в смоделированных донорах (рис. 1, шаг 7).Все акцепторы на расстоянии, вдвое превышающем радиус Ферстера от донора, с учетом длины линкера как донора, так и акцептора, проверяются на их доступность для FRET в течение этого временного интервала. Вероятность оставаться возбужденным затем рассчитывается для каждого донора на основе его текущего окружения (уравнение 2) и сравнивается со случайной вероятностью оставаться возбужденным или нет (рисунок 1, шаг 8). В случае деактивации тип деактивации определяется путем определения интервалов вероятности из отношения скоростей деактивации различных процессов и сравнения с другой случайной вероятностью.Процесс деактивации, представляющий этот интервал, выбирается для деактивации (рисунок 1, шаг 9). Индивидуальные процессы деактивации суммируются для каждого смоделированного временного интервала. Следует отметить, что все фотоны, испускаемые в течение одного цикла возбуждения, считаются за заданный интервал времени. Это сделано потому, что предполагается, что зависящие от времени вариации вероятности обнаружения фотонов (под углом обнаружения) имеют второстепенное значение для моделируемых систем; также в действительности частота счета фотонов должна быть достаточно низкой, чтобы не вносить значительного вклада и не обнаруживать более одного фотона в цикле возбуждения.Если донор деактивируется посредством события FRET, соответствующий акцептор возбуждается и, следовательно, временно блокируется для другой передачи энергии (рис. 1, этап 11).

Вывод моделирования

Вывод состоит из всех идентификаторов доноров, у которых нет акцептора на соответствующем расстоянии, а также включает таблицу, содержащую частоты всех процессов дезактивации доноров, наблюдаемых в каждом временном интервале. Общее количество деактиваций акцептора включается в вывод.Соотношение скоростей дезактивации для каждого акцептора обычно остается постоянным с течением времени. Следовательно, дезактивация акцептора представляет собой качественную гистограмму TCSPC, учитывая зависящую от времени картину возбуждения этой системы FRET. Обратите внимание, что распады акцептора полностью моделируются только в том случае, если циклы возбуждения не прекращаются после дезактивации всех доноров. Чтобы сравнить сигнал акцептора с экспериментально зарегистрированной статистикой акцепторных фотонов и установить их по отношению к наблюдаемому сигналу донора, предполагая известное соотношение вероятности обнаружения двумя системами обнаружения, используется только квантовый выход акцептора Φ _{Необходимо определить} .

$$ {\ varPhi} _A = \ frac {k_ {Флуоресценция}} {{\ displaystyle \ sum_i {k} _i}} $$

(3)

где k _{Флуоресценция} отображает скорость дезактивации излучением фотонов. Для сравнения с экспериментальными данными смоделированный распад фотона должен быть свернут с функциями отклика прибора в день измерения для данного канала красителя, чтобы реализовать временную зависимость плотности вероятности обнаружения приборной установки.

Измерения времени затухания флуоресценции

Время затухания флуоресценции регистрировали на спектрометре FL920 (Edinburgh Instruments), работающем в режиме TCSPC. При измерениях использовалось временное окно 50 нс и 1024 канала. Образцы возбуждали при λ _ex = 450 нм с использованием источника суперконтинуума SC-400-PP (Fianum), и эмиссия была собрана на λ _em = 525 нм с использованием поляризатора, установленного под магическим углом, и многоканальной пластинки (европотон) в качестве детектора.Частота следования источника возбуждающего света была установлена ​​на 10 МГц.

Квантовый выход и определение радиуса Фёрстера

Используя систему измерения квантового выхода фотолюминесценции (PL) (C9920, Hamamatu Photonics), квантовый выход Φ _D для донора определено равным 0,6. На основании этого был определен радиус Ферстера, равный 5,4 нм (уравнение 4), если предположить, что рандомизация ориентации красителя происходит намного быстрее, чем время затухания флуоресценции.Показатель преломления 1,33. Интеграл перекрытия J ( λ ) был рассчитан из зарегистрированных спектров излучения донора и поглощения акцептора, определенных с помощью QuantaMaster 40 (Photon Technology International) с программным обеспечением Felix32. Радиус Ферстера является функцией κ ² , описывающий взаимную ориентацию диполей донорного и акцепторного переходов, квантовый выход донора Φ _D , показатель преломления n раствора и интеграл перекрытия J ( λ ) между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора:

$$ {R} _0 = \ sqrt [6] { \ frac {9 \ times \ ln (10) \ times {\ kappa} ^ 2 \ times {\ varPhi} _D \ times J \ left (\ lambda \ right)} {128 \ times {\ pi} ^ 5 \ times {N} _A \ times {n} ^ 4}} $$

(4)

где N _A — это число Авогадро.

Теоретические расчеты

Для проверки согласованности нашего кода с теорией резонансного переноса энергии Фёрстера мы вычислили вероятность излучения фотона. Для нескольких расстояний результирующие распределения были установлены в зависимости от их веса в соответствии с ожидаемыми фотонами в течение первого временного интервала на основе вероятности испускания фотонов и доли возбужденных доноров в конкретном окружении.

$$ {N} _P (t) = {\ displaystyle {\ sum} _i {f} _ {D, i}} \ times \ frac {d {D} _ {я, выбросы}} {dt} = {\ displaystyle {\ sum} _i {f} _ {D, i}} \ times {k} _ {выделение} \ times \ exp \ left (- {\ displaystyle {\ sum} _j {k} _j} \ times \ varDelta t \ right) $$

(5)

где N _P ( t ) — количество фотонов в зависимости от времени, f _{D, i} — доля доноров с окружением i , k Эмиссия — скорость эмиссии донора, а сумма k j представляет объединенную константу скорости деактивации для всех процессов деактивации.Производная d D _{i, выбросы} / d t представляют собой деактивации по выбросам за единицу времени в заданный момент времени. Его нельзя считать постоянным из-за событий распада фотонов доноров с очень близкими акцепторами в более ранние моменты времени, чем разрешено типичным экспериментальным временным разрешением. Поэтому в первом временном интервале он был определен для 1000 равных подинтервалов и впоследствии усреднен. [Для получения дополнительной информации см. Дополнительный файл 1.]

Код доступа

Код размещен в домене платформы открытого доступа (http://figshare.com/) и имеет номер доступа: 1158992 (http://figshare.com/articles/FRET/1158992) .

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Умеренное влияние хромофоров FRET на свойства развернутых белков

% PDF-1.7 % 1 0 объект > эндобдж 10 0 obj / Создатель (Elsevier) / Производитель (Acrobat Distiller 8.1.0 \ (Windows \)) / ElsevierWebPDFS Технические характеристики (6.4) / CrossmarkDomainExclusive (истина) / роботы (noindex) / ModDate (D: 2014092

55 + 05’30 ‘) / doi (10.1016 / j.bpj.2014.07.071) / CrossMarkDomains # 5B1 # 5D (sciencedirect.com) / Title (Умеренное влияние хромофоров FRET на свойства развернутых белков) >> эндобдж 2 0 obj > эндобдж 3 0 obj > эндобдж 4 0 obj > транслировать application / pdfdoi: 10.1016 / j.bpj.2014.07.071