Предохранитель эур калина где находится: Лада калина предохранитель эур – АвтоТоп

Ремонт электроусилителя руля Лада Калина

Зачастую электро усилитель руля (ЭУР) отказывается работать как на новых автомобилях Лада Калина, так и на автомобилях с большим пробегом. При возникновении проблем на приборной панели загорается ошибка желтого цвета в виде руля с восклицательным знаком.

Она свидетельствует о неисправностях в работе или отказе электро-усилителя руля. Следует иметь в виду, что желтый цвет говорит о том, что проблема не является критичной и управлять автомобилем можно и без помощи электроусилителя. В случае его отказа лучше вытащить предохранитель ЭУР, который находится слева от руля.

Ремонт электроусилителя руля Лада Калина своими руками необходимо проводить по разным причинам.

Основные причины неисправности электроусилителя руля:

1. Неисправности в самом электроусилителе руля. При включении зажигания ЭУР не проходит самоконтроля и сам отключается, чтобы не мешать водителю и не вызывать аварийных ситуаций на дороге.

В такой ситуации ремонт обойдется достаточно дорого и при действующей гарантии лучше ей воспользоваться.

2. Неисправности датчика скорости, что является довольно частой причиной. В такой ситуации ремонт будет недорогим и можно будет сделать его самостоятельно. Дело в том, что работает ЭУР не с постоянным усилием, которое прилагается к рулевой рейки. Он работает на полную мощность только когда автомобиль едет на небольшой скорости или стоит на месте. Разгоняясь на автомобиле, электроусилитель руля уменьшает усилия на рулевую рейку, тем самым водитель может лучше контролировать ход автомобиля. Таким образом, чем выше скорость, тем меньше работает ЭУР, помогая этим водителю. ЭУР считывает скорость автомобиля со спидометра, который получает данные от датчика скорости. Иногда датчик ломается и выдает неверную информацию. В результате, ЭУР отключается, так как не знает скорости автомобиля. После этого на приборной панели загорается ошибка ЭУР. В таком случае, ремонт электроусилителя руля калина проводится путем замены датчика.

Видео. Какие бывают неисправности руля Лада Калина:

Чтобы избежать преждевременного ремонта электроусилителя руля калина следует проводить своевременную диагностику, для выявления проблем его функционирования и оценки его работоспособности. Напомню, что предыдущая статья была про замену задних тормозных колодок своими руками.

Отзыв владельца автомобиля LADA (ВАЗ) Kalina 2013 года ( II ): 1.6 MT (87 л.с.)

08,11,2013 г.

Итак, продал Калину универсал первой версии 2011 г. выпуска, купил Калину универсал нового образца, между продажей - покупкой прошло 2 дня, все воспоминания свежи. 

Первое что хочется - сравнить их между собой.   Вот дневник первой моей Калины http://my.auto.ru/review/4019374/. Она была простая: ЭУР, передние стеклоподы, 1,6 мотор 8 кл, ну и все. Теперь комплектация богатая, есть все кроме мультимедиа и подогрева переднего стекла с парктроником. Пробег - 19 км. 

Начну. Внешний вид - безусловный шаг вперед, глаз радуется, цвет "Гранта". Релинги на крыше, новый бампер и фары, все вместе смотрятся гармонично. Сел в машину. Ну, как в старой, просторно, только опять же все поприятнее выглядит: салон и пластик черный вместо серокоричневого. Ворсовые коврики в салон и багажник со старой машины как родные переехали на новую. Запилю список плюсов и минусов, буду потихоньку его дополнять.

Плюсы:

1. Глаз радуется - все очень современно выглядит.

2. Новая коробка - маленькие ходы рычага КПП, удивительная четкость и легкость работы, вибрации нет, вставка не дребезжит - по сравнению с предыдущей - космос, пожалуй даже лучше, чем была на Опеле Комбо 2005 г.в.

3.
  Усилие на педалях - было и так легко, стало ну просто воздушно

4. В салоне нет вибрации от мотора, на предыдущей - как в массажном кресле

5. Задняя включается гораздо лучше, чем раньше, никакого сравнения

6. Мотор более резвый однозначно

7. Шумоизоляция сделала не прыжок, но все таки шаг вперед, разницу не заметить невозможно.

8. Все крутилки климата с механики стали электронными - приятно неимоверно.

9. Стеклоподъемники получили авто режим

10. Электронный замок багажника

11. Перестали отвисать противосолнечные козырьки, наконец-то!

Минусы:

1. Трехспицевый руль. Старый, четырехспицевый, был мне удобнее.

2. Цифры на спидометре мелковаты

Вот пока и все! Завтра за номерами, техосмотр проходить 3 года не надо.

11 ноября 2013

11.11.13 пробег 125 км

В выходные поехал ставить машину на учет, получать номера. Оказалось их выдают в новом месте.  Включил навигатор, посмотреть как туда проехать, стал включать в прикуриватель - что-то замкнуло, сгорел предохранитель. Точно такая же лабуда была на старой Калине: в сервисе мне что-то сделали и замыкания прекратились, но перестал работать нагреватель прикуривателя. Почему так - не знаю, я не курю, мне все равно, а навигатором пользуюсь часто. Заеду в сервис, он от дома у меня через дорогу.

Дополню плюсами и минусами, свойственными всем Калинам:

+  в машине просторно вбок и вверх, особенно спереди (мой рост 182 см), тепло, отличная обзорность и большие зеркала, большой багажник

+  высокий дорожный просвет + короткие свесы и плоское дно дают хорошую проходимость, я часто езжу в леса на рыбалки и прочее, плюс по городу постоянно заезжаю на бордюры и прочие неудобные места

- стекла так и не опускаются до конца

Плюсы и минусы именно Калины II:

+ машину наконец-то научили ехать по прямой на скорости! больше никуда не болтает, едет как по рельсам

+ сделали прочные и жесткие боковины в багажнике, и полку доработали, ничего не болтается 

+ радует толковая работа климатической системы в режиме авто, выставил температуру в первый день и вентилятор сделал на АВТО и всё, само работает как надо

+ функция "быстрое отпотевание стекол" реально работает

- звук поворотников бип-бип-бип.
  .. не надоедает (пока), но на грани

- крепления IZOFIX - заявлены, но по факту отсутствуют, не поленился заехать в салон и оглядел Калины всех комплектаций

может эти плюсы товарищам иномарочникам покажутся смешными, но людей от сохи, таких как я, очень радуют.

13 ноября 2013

13.11.13 пробег 290 км

Купил сегодня предохранитель поменять прикуривателя и попогрейки 20А - 10 р. Для справки: в сервисе замена его стоит, внимание! - 200 р. Естественно менять сам стал. Новая конструкция крышки предохранителей теперь крепиться не на 2, а на 6 креплений новой конструкции. Стал открывать, по инструкции, аккуратно, но толи руки у меня кривые, толи пластик крышки мягкий, в общем одно крепление всё равно сломал. Поменял предохранитель, защелкнул крышку и поехал дальше. Попогрейки греют, но нагреваются ощутимо медленнее, чем на Тигуане.

17 ноября 2013

17.11.13 г. пробег 368 км

Поставил сегодня магнитолу старенькую на дисках МР3, но без флешки, установка простейшая.  Косяк вышел с радио: в калине разъем нового типа, а у меня на магнитоле старый, круглый, куплю переходник позже. Стал ставить динамики - и очень удивился, оказалось что все 4 шт уже установлены на заводе, ставлю маленький плюсик. Все динамики в дверях, внизу, звучание для галочки. А с учетом того, что дома музыка, кино, и игры идут через домашний кинотеатр (http://www.sony.ru/product/hcs-surround-kit---dvd-player/dav-dz710) слушать музыку в машине та еще радость.

Салон и обивка сидений черные, выглядит конечно красиво по сравнению со старым, серым, но любая грязь сразу заметна, не так практично. Дети постоянно ерзают туда сюда, постоянно протирать приходиться. 

Температура за бортом с момента покупки от +5 до -2, расход топлива по БК - 10,1 л, ездил это время 90% по городу, средняя скорость по навигатору 27 км/ч.

19 ноября 2013

19.11.13 г. пробег 435 км

Немного я ошибся: провод от антенны есть, с обычным, круглым разъемом. Только вот находиться он. .. под ковровым покрытием переднего пассажира! Минут 15 потребовалось чтоб просунуть его куда надо, не понимаю, почему это нельзя было сделать на заводе? Ну вот, радио заработало, в городе ловит без проблем.

Все дни сырость, грязь, уезжаю из дома еще темно, приезжаю - уже темно. И если сперва были сомневался, то теперь точно уверен: ближний свет у Калины II стал заметно лучше. А еще фары меньше стало закидывать грязью. Пустяк, но приятно, меньше с тряпкой бегать.

22 ноября 2013

22.11.13 пробег 496 км

Закончился первый бак топлива, заправленный мною сразу после покупки машины. Пробег из салона был 20 км, сейчас - 496 км, показания расхода топлива по БК - 10,3 л/100 км. Проверим: 496км-20км/10,3л=46,21 л. Прибавляем 3 л с завода выходит 49,21 л при емкости бака 50 л. Всё сходиться, БК показывает точные данные. 

Могу добавить, что точность уровня топлива повысилась: на Калине 1 когда загоралась лампочка топлива, прогноз по БК был 60 - 50 км, и на этом показывать его переставал, оставалось смотреть на стрелку уровня топлива.   На новой Калине лампа загорелась тоже на примерно 50 км, уровень топлива был 2 деления шкалы. Прогноз показывался вплоть до 23 км осталось, затем погас, на индикаторе осталось 1 деление. На свой страх и риск, в целях эксперимента, я проехал еще 16 км, последнее деление на индикаторе пропало, показывало пустой бак. Дальше рисковать не стал, заехал на заправку.

Теперь небольшой минус: почему убрали регулятор интенсивности подсветки приборов? Например когда я долго ночью еду по трассе (такое бывает 3-5 раз в год), всегда его убавляю, т.к для привыкших к темноте глаз становиться ярковато и не комфортно. Еще. Раньше было 2 кнопки на подлокотнике: одна закрыть двери - другая открыть, все было просто и удобно, теперь она одна. Неудобство в чем: открывая машину с сигналки, открывается только водительская дверь. Сажусь в машину, жму закрыть - открываются все остальные двери, приходиться нажимать еще раз. Конечно это все мелочи, но на фоне множества других улучшений вызывают дискомфорт.
  

P.S: Почитал коменты и хочу сказать: на моей машине проблем с открыванием/закрыванием дверей на данный момент нет.

26 ноября 2013

26.11.13 пробег 620 км ДТП

И на старуху, как говориться, бывает... Первое за 8 лет ДТП, в котором виноват я. Был в у родственников в бане, в частном секторе. Вечером, отъезжая от дома задним ходом, не заметил (а если честно даже не посмотрел) припаркованную за мной Шкоду Октавию. Бортом протаранил ей морду... Отломил передний бампер, фару, помял крыло. Перед человеком неудобно до жути... На моей вмятин нет, отделался царапинами.

10 декабря 2013

10.12.13 пробег 1079 км

Машина приучает меня к чистоте. Как я уже писал, черный пластик и салон выглядит здорово, но любая грязь видна сразу. После каждой поездки с детьми/собакой что нибудь приходиться протирать и чистить.

Столбик термометра упал ниже -10, под потолком проснулись сверчки, пара у плафона освещения (обивка потолка о стекло), где-то вверху слева и где-то еще справа в панели, еще не понял (пользователь myhidalgo очень обрадуется прочитав это).   С прогревом машины они уходят, но раздражают своим существованием. После установки магнитолы стали побрякивать на кочках провода от магнитолы, когда надоест - переделаю.

В прошлый раз забыл написать вот еще что: когда на шинке меняли колеса - летние на зимние - машину домкратом подняли за порог на 2 колеса. Я открыл багажник, закинул туда летние колеса. а вот закрыть уже не смог - замок багажника и ответная часть не совпадали примерно на 6 мм. Когда машину снова поставили на 4 колеса, багажник закрылся без проблем. Не припомню, было ли такое на первой Калине.

Как и в молодости, машина внезапно сгодилась как место для новых встреч - оказалось что общаться удобнее на отодвинутом и разложенном переднем сидении, а не на заднем.

Пепельница пригодилась как стакан, пусть с крышкой пить не очень удобно, зато ее никогда не забудешь, всегда в машине.

9 января 2014

10.01.14 пробег 3794 км ДТП-2

Все началось с того, что 25,12,13 погода вдруг из глубокого минуса перешла в плюс.  Намерзший снег стал таять, и с потолка у правого козырька стала капать вода.

Подушка водительского сиденья уже просела на столько, что на кочках попой отчетливо чувствую две параллельные железки, на первой Калине такого не было, сиденья были более упругие, и до продажи даже намеков на такую фигню не было.

Вечером 27,12,13 надо было срочно съездить по делам, сел в машину, повернул ключ зажигания и вдруг все погасло и перестало работать: подсветка, фары, стартер, магнитола - вообще вся электрика. Посидел я в машине пару минут, решил скинуть аккум и одеть обратно, как вдруг все само собой восстановилось и загорелось, однако все данные, кроме одометра обнулились. Больше такое не повторялось.

28,12,13 под самый новый год, судьба послала мне в борт торпеду в виде черного ВАЗ 2114... Печальный итог на фото, жду страховую. Не хотелось бы чтоб ее ремонтировали, какая-то невезучая эта машинка. Грусть и тоска, ездить то не на чем теперь...

11 февраля 2014

Минутка печали и ненависти

Отдал документы по ДТП в страховую 30,12,12 г.  На сегодня, 11,02,13 г. еще только готова калькуляция на ремонт - 182 000 р - и передана на согласование в страховую. Как говорят в сервисе, пока все согласуют и отремонтируют, пройдет еще месяцы полтора... Ребята, это просто песец, как меняется жизнь без машины.

2 апреля 2014

Свет в конце тоннеля…

Получил от страховой сегодня бумагу, что машину восстанавливать не будут, а выплатят страховую сумму. Очень этому рад, на ремонтированной машине ездить не хотелось. Сижу щас думаю: снова взять такую Калину, или перешагнув себя все таки Ларгус...

20 августа 2014

Развязка

Долго ли коротко, дождался я денег от страховой, успел поработать на севере, и вот наконец-то пошел снова покупать Калину 2 универсал, теперь только в самой полной комплектации с МКПП.

Ремонт электроусилителя руля Лада Калина

×

Статус

Данная статья устарела. Смотрите обновленный вариант здесь

Признаки неисправности электроусилителя руля

Зачастую электроусилитель руля (ЭУР) отказывается работать как на новых автомобилях Лада Калина, так и на автомобилях с большим пробегом. При возникновении проблем на приборной панели загорается ошибка желтого цвета в виде руля с восклицательным знаком. Она свидетельствует о неисправностях в работе или отказе электроусилителя руля. Следует иметь в виду, что желтый цвет говорит о том, что проблема не является критичной и управлять автомобилем можно и без помощи электроусилителя. В случае его отказа лучше вытащить предохранитель ЭУР, который находится слева от руля.

Ремонт электроусилителя руля калина необходимо проводить по разным причинам.

Основные причины неисправности электроусилителя руля:

• Неисправности в самом электроусилителе руля. При включении зажигания ЭУР не проходит самоконтроля и сам отключается, чтобы не мешать водителю и не вызывать аварийных ситуаций на дороге. В такой ситуации ремонт обойдется достаточно дорого и при действующей гарантии лучше ей воспользоваться.
• Неисправности датчика скорости, что является довольно частой причиной. В такой ситуации ремонт будет недорогим и можно будет сделать его самостоятельно. Дело в том, что работает ЭУР не с постоянным усилием, которое прилагается к рулевой рейки. Он работает на полную мощность только когда автомобиль едет на небольшой скорости или стоит на месте. Разгоняясь на автомобиле, электроусилитель руля уменьшает усилия на рулевую рейку, тем самым водитель может лучше контролировать ход автомобиля. Таким образом, чем выше скорость, тем меньше работает ЭУР, помогая этим водителю. ЭУР считывает скорость автомобиля со спидометра, который получает данные от датчика скорости. Иногда датчик ломается и выдает неверную информацию. В результате, ЭУР отключается, так как не знает скорости автомобиля. После этого на приборной панели загорается ошибка ЭУР. В таком случае, ремонт электроусилителя руля калина проводится путем замены датчика.

Чтобы избежать преждевременного ремонта электроусилителя руля калина следует проводить своевременную диагностику, для выявления проблем его функционирования и оценки его работоспособности.

Найти полезную информацию о ремонте рулевого управления вы можете здесь.

15.11.2012

Facebook

Twitter

Вконтакте

Одноклассники

Нашли ошибку? Выделите текст мышью и нажмите Ctrl+Enter

Была ли эта информация полезной?

Автозапчасти — alvadi.ee

+372 Эстония + 358 Финляндия + 371 Латвия + 370 Литва + 7 Россия + 45 Дания + 47 Норвегия + 46 Швеция + 375 Беларусь + 380 Украина + 48 Польша + 93 Афганистан + 355 Албания + 213 Алжир + 1 Американское Самоа + 376 Андорра + 244 Ангола + 1 Ангилья + 1 Антигуа и Барбуда + 54 Аргентина + 374 Армения + 297 Аруба + 61 Австралия + 43 Австрия + 994 Азербайджан + 1 Багамы + 973 Бахрейн + 880 Бангладеш + 1 Барбадос + 375 Беларусь + 32 Бельгия + 501 Белиз + 229 Бенин + 1 Бермудские острова + 975 Бутан + 591 Боливия + 387 Босния и Герцеговина + 267 Ботсвана + 55 Бразилия + 246 Британская территория в Индийском океане + 673 Бруней-Даруссалам + 359 Болгария + 226 Буркина-Фасо + 257 Бурунди + 855 Камбоджа + 237 Камерун + 1 Канада + 238 Кабо-Верде + 1 Каймановы острова + 236 Центральноафриканская Республика + 235 Чад + 56 Чили + 86 Китай + 57 Колумбия + 269 Коморские Острова + 242 Конго + 243 Конго, Демократическая Республика + 682 Острова Кука + 506 Коста-Рика + 225 Кот-д’Ивуар + 385 Хорватия + 53 Куба + 357 Кипр + 420 Чехия + 45 Дания + 253 Джибути + 1 Доминика + 1 Доминиканская Республика + 593 Эквадор + 20 Египет + 503 Сальвадор + 240 Экваториальная Гвинея + 29 1 Эритрея + 372 Эстония + 251 Эфиопия + 500 Фолклендских (Мальвинских) островов +298 Фарерских островов + 691 Федеративные Штаты Микронезии + 679 Фиджи + 358 Финляндия + 33 Франция + 594 Французская Гвиана + 689 Французская Полинезия + 241 Габон + 220 Гамбия + 995 Грузия + 49 Германия + 233 Гана + 350 Гибралтар + 30 Греция + 299 Гренландия + 1 Гренада + 590 Гваделупа + 1 Гуам + 502 Гватемала + 224 Гвинея + 245 Гвинея-Бисау + 592 Гайана + 509 Гаити + 39 Святой Престол (Государство Ватикан) ) +504 Гондурас + 852 Гонконг + 36 Венгрия + 354 Исландия + 91 Индия + 62 Индонезия + 98 Иран + 964 Ирак + 353 Ирландия + 972 Израиль + 39 Италия + 1 Ямайка + 81 Япония + 962 Иордания + 7 Казахстан + 254 Кения +686 Кирибати + 850 Корея, Народно-Демократическая Республика + 82 Корея, Республика + 965 Кувейт + 996 Кыргызстан + 856 Лаос + 371 Латвия + 961 Ливан + 266 Лесото + 231 Либерия + 218 Ливийская Арабская Джамахирия + 423 Лихтенштейн + 370 Литва + 352 Люксембург + 853 Макао + 389 Македония + 261 Мадагаскар + 265 Малави + 60 Малайзия + 960 Мальдивы + 223 Мали + 356 Мальта + 692 Маршалловы острова + 596 Мартиника + 222 Мавритания + 230 Маврикий + 262 Майотта + 52 Мексика + 373 Молдова + 377 Монако + 976 Монголия + 382 Черногория + 1 Монтсеррат + 212 Марокко + 258 Мозамбик + 95 Мьянма + 264 Намибия + 674 Науру + 977 Непал + 31 Нидерланды + 599 Нидерландские Антильские острова + 687 Новая Каледония + 64 Новая Зеландия + 505 Никарагуа +227 Нигер + 234 Нигерия + 683 Ниуэ + 672 Остров Норфолк + 1 Северные Марианские острова + 47 Норвегия + 968 Оман + 92 Пакистан + 680 Палау + 970 Палестинская территория + 507 Панама + 675 Папуа-Новая Гвинея + 595 Парагвай + 51 Перу + 63 Филиппины + 48 Польша + 351 Португалия + 1 Пуэрто-Рико + 974 Катар + 262 Реюньон + 40 Румыния + 7 Россия + 250 Руанда + 590 Сент-Бартелемей + 290 Остров Святой Елены + 1 Сент-Китс и Невис + 1 Сент-Люсия + 590 Сен-Мартен + 508 Сен-Пьер и Микелон + 1 Сент-Винсент и Гренадины + 685 Самоа + 378 Сан-Марино + 239 Сан-Томе и Принсипи + 966 Саудовская Аравия + 221 Сенегал + 381 Сербия + 248 Сейшельские острова + 232 Сьерра-Леоне + 65 Сингапур + 421 Словакия + 386 Словения +677 Соломоновы Острова + 252 Сомали + 27 Южная Африка + 34 Испания + 94 Шри-Ланка + 249 Судан + 597 Суринам + 268 Свазиленд + 46 Швеция + 41 Швейцария + 963 Сирийская Арабская Республика + 886 Тайвань + 992 Таджикистан + 66 Таиланд + 670 Тимор-Лешти + 228 Того + 690 Токелау + 676 Тонга + 1 Тринидад и Тобаго + 216 Тунис + 90 Турция + 993 Туркменистан + 1 острова Теркс и Кайкос + 688 Тувалу + 256 Уганда + 380 Украина + 971 Объединенные Арабские Эмираты + 44 Соединенное Королевство + 255 Объединенная Республика Танзания + 1 США + 598 Уругвай + 1 Виргинские острова США + 998 Узбекистан + 678 Вануату + 58 Венесуэла + 84 Вьетнам + 1 Виргинские острова, Британия + 681 Уоллис и Футуна + 967 Йемен + 260 Замбия + 263 Зимбабве

Дендритные клетки человека, созданные с помощью генной инженерии для экспрессии цитозоло-удерживаемого фрагмента простатспецифического мембранного антигена, первичного цитотоксического Т-клеточного ответа на множественные эпитопы

Весь человеческий клеточный материал, использованный в этих экспериментах, был получен после информированного согласия по протоколам, утвержденным местным комитетом по биоэтике (Болгария) или Институциональный обзорный совет (IRB) в Медицинском центре Университета Джорджа Вашингтона в Вашингтоне, округ Колумбия.

Конструирование плазмид tPSMA и sPSMA

кДНК, кодирующая внеклеточную часть (AA 44-750) человеческого PSMA (XC-PSMA), была клонирована в вектор pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) после RT-PCR общая мРНК из линии клеток рака простаты человека LNCaP (CRL 1740, ATCC). Прямой праймер вводил сайт клонирования Not I и последовательность Козака с кодоном Met (GCCACCATG) на 5′-конце XC-PSMA. Плазмида tPSMA для экспериментов по трансфекции была получена путем субклонирования Not I– Xho I XC-PSMA в вектор экспрессии млекопитающих pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA).Секретируемый вариант плазмиды tPSMA — плазмида sPSMA — был получен путем слияния XC-PSMA с лидерной последовательностью k-цепи мышиного Ig. Вставку из плазмиды tPSMA субклонировали с помощью Bam HI- Xho I в вектор экспрессии млекопитающих pSecTag2A (Invitrogen, Carlsbad, CA), обеспечивая лидерную последовательность мышиного Igk (клон 96). Одиночный сайт клонирования вектора Sfi I использовали для слияния XC-PSMA в рамке считывания с лидером. 5′-часть XC-PSMA между началом Met и единственным сайтом Hpa I была повторно усилена, чтобы ввести сайт Sfi I (кодон Met не был включен).Фрагмент Sfi I– Hpa I клона 96 заменяли продуктом ПЦР, предварительно расщепленным теми же эндонуклеазами рестрикции, и фрагмент Nru I– Xho I из полученной конструкции перемещали в вектор pVAX1. Вставки в обеих конструкциях регулируются предранним промотором / энхансером человеческого цитомегаловируса (CMV) и сигналом полиаденилирования бычьего гормона роста. Спецификации плазмидной ДНК включают: содержание эндотоксина ниже 0.1 ЕС на микрограмм ДНК; отсутствие детектируемых количеств бактериальной РНК, геномной ДНК или оцДНК, определяемых электрофорезом в агарозном геле; менее 10 мкг г белка на 1 мг плазмидной ДНК по данным колориметрического анализа (Bio-Rad, Hercules, CA).

Трансфекция COS-1

Экспрессию конструкций PSMA проводили в клетках Cos-1 (ATCC). Монослои трансфицировали реагентом для трансфекции FuGENE 6 (Roche) и анализировали на продукцию PSMA с помощью вестерн-блоттинга. Клетки Cos-1 высевали в шестилуночные планшеты для тканевых культур (Nunc, Дания) на 1.5 × 10 ⁵ клеток на лунку и выращенных до 50–70% слияния в среде DMEM с добавлением 25 мМ HEPES (pH 7,5), 1 мМ пирувата натрия, 3,7 г / л бикарбоната натрия, 100 мкл г / мл пенициллина, 100 μ мкг / мл стрептомицина, 0,25 μ мкг / мл амфотерицина B и 10% (об. / Об.) Инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки. Клетки Cos-1 трансфицировали 1,5 мкл г плазмидной ДНК, предварительно конденсированной с 4,5 мкл мкл реагента FuGENE 6 в бессывороточной среде DMEM в течение 30 минут при комнатной температуре.Затем клетки выращивали в течение 72 часов в среде DMEM с добавками, а затем собирали.

В исследованиях ингибирования протеасом в культуральную среду добавляли лактацистин (Sigma) (конечная концентрация 10 мкМ М) за 24 часа до сбора урожая.

Клетки собирали осторожным соскобом после двойной промывки 2 мл холодного PBS и добавлением 0,25 мл холодного буфера для лизиса (0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,2% Tween 20, 50 мМ HEPES, pH 7,0). к каждому колодцу. Лизаты переносили в пробирки Эппендорфа и гомогенизировали повторным пипетированием на льду.

Для обнаружения секретированного PSMA сыворотку, содержащую DMEM, удаляли через 48 часов после трансфекции, клетки дважды промывали 2 мл PBS, затем добавляли бессывороточную среду DMEM (2 мл на лунку) и клетки инкубировали для дополнительной 24 часа в 6-луночных планшетах. После сбора среды остатки клеток удаляли центрифугированием (35000 г , 20 минут), а супернатанты концентрировали с помощью центрифужного фильтрующего устройства Centricon-50 (Millipore) и хранили при -30 ° C до дальнейшего использования.

Дегликозилирование PSMA

Дегликозилирование белков PSMA проводили обработкой 25 мкл г образцов белка 5 ед. Гликопептидазы F из Chryseobacterium Meningosepticum (Sigma) в 50 мМ фосфатном буфере (pH 7,5), содержащем 0,1% ( w / v) SDS, 50 мМ β -меркаптоэтанол, 0,75% (об. / об.) Triton X-100 в течение 4 часов при 37 ° C. ²²

Внеклеточная часть человеческой глутаматкарбоксипептидазы II (AA 44-750) в клетках Drosophila Schneider, очищенная до гомогенности, ²³ была предоставлена ​​д-ром Яном Конвалинкой, Институт органической химии и биохимии Чешской академии наук. , Прага, Чехия.

Электрофорез и иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг и электрофоретические анализы клеточных лизатов и культуральных супернатантов проводили с использованием электрофоретической системы NuPage BioTris (Invitrogen). Образцы белка в загрузочном буфере нагревали при 70 ° C в течение 10 минут и наносили на 10% -ные гели Bis-Tris. После электрофореза и электропереноса нитроцеллюлозную мембрану блокировали 1% казеином в TBS / T в течение 40 минут. Мембраны зондировали поли- или моноклональными антителами к PSMA (см. Ниже) в течение 1 часа при комнатной температуре.Детектирование проводили с использованием конъюгатов козьих антител против кроличьих или антител к мышиным IgG-HRP (Sigma) и визуализировали с помощью хемолюминесцентного субстрата WestPico Super Signal (Pierce) в соответствии с рекомендациями производителя.

Моноклональные антитела против человеческого PSMA Y-PSMA1 и Y-PSMA2 были получены от Yes Biotech Laboratories Ltd (Миссиссауга, Онтарио, Канада).

Культура клеток и генерация DC из моноцитов

Культуры клеток из мононуклеарных клеток периферической крови поддерживали в бессывороточной среде AIM-V исследовательского класса (Invitrogen, Carlsbad, CA).Клеточная линия рака простаты человека LNCaP была приобретена в ATCC и поддерживалась в RPMI с добавлением 10% FCS (Life Technologies Inc., Роквилл, Мэриленд), 2 мМ L-глутамина, 50 Ед / мл пенициллина и 50 мкг г / мл стрептомицина. Линия клеток Т2 человека является транспортером, связанным с процессингом антигена (ТАР), дефицитным, что приводит к неэффективной загрузке молекул лейкоцитарного антигена класса I эндогенными пептидами. ²⁴ Как следствие, молекулы HLA-A0201 клеток Т2 могут быть эффективно загружены экзогенными пептидами.Клеточная линия T2 была приобретена в ATCC и сохранена в IMDM с добавлением 20% FBS (Life Technologies Inc., Rockville, MD).

Для стимуляции Т-клеток фракцию лейкоцитов собирали с помощью лейкафереза ​​и мононуклеарные клетки разделяли в градиенте плотности. Клетки ресуспендировали в бессывороточной среде AIM-V при 2 × 10 ⁷ / мл и инкубировали в течение 2 часов в увлажненном инкубаторе при 37 ° C. Фракцию, обогащенную неприлипшими Т-клетками, и часть прикрепленных клеток собирали и замораживали для будущего использования.Для удобства эти клетки упоминаются в тексте как «Т-клетки», несмотря на тот факт, что эта неприлипающая фракция также содержит В-клетки и NK-клетки.

Остальные адгезивные клетки были дифференцированы в DC путем культивирования в бессывороточной среде AIM-V с добавлением IL-4 (PeproTech, Rocky Hill, NJ) и GM-CSF (Oncology Supplies Inc., Дотан, штат Алабама) для 6 дней. Неприкрепленные клетки собирали и использовали для трансфекции. Трансфекцию проводили с использованием устройства Nucleofector ™ и соответствующего набора для трансфекции (Amaxa GmbH, Кельн, Германия).Эффективность трансфекции Nucleofector ™ человеческих DC составляла 32 ± 8,8% ( n = 5), по оценке контрольной трансфекции зеленым флуоресцентным белком (GFP). После трансфекции DC ресуспендировали в бессывороточной среде AIM-V и созревали с TNF- α (Becton Dickinson Inc., Бедфорд, Массачусетс) при 37 ° C в течение 24 часов. После созревания DC ресуспендировали в среде AIM-V при концентрации 1 × 10 ⁵ клеток / мл.

In vitro генерирование CTL-ответов

Для стимуляции Т-клеток фракцию, обогащенную Т-клетками, размораживали, промывали, ресуспендировали в среде AIM-V и добавляли к суспензии DC, чтобы конечная концентрация Фракция, обогащенная Т-клетками, составляла 1 × 10 ⁶ клеток / мл.Затем клеточную суспензию распределяли в 24-луночные планшеты (1 мл / лунку) и культивировали при 37 ° C. Через 3 дня среду заменяли бессывороточной средой AIV-M с добавлением человеческого IL-2 (20 Ед / мл) и человеческого IL-7 (10 Ед / мл) (PeproTech, Rocky Hill, NJ). Клетки дополнительно стимулировали аутологичными DC, трансфицированными PSMA (соотношение стимулятор: эффектор 1:10) или импульсными пептидами аутологичными моноцитами (соотношение стимулятор: эффектор 1: 1) дважды с интервалом в 8 дней.

Для пульсации пептидами моноциты ресуспендировали при 10 ⁶ / мл в бессывороточной среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина и пенициллина / стрептомицина.Пептид добавляли до конечной концентрации 0,05 мг / мл, и клетки инкубировали в течение 4 часов при 37 ° C в контролируемом увлажненном инкубаторе CO ₂ . Затем клетки дважды промывали бессывороточной средой, облучали (1500 рад) и ресуспендировали в среде, содержащей IL-2 и IL-7.

Для анализа цитотоксичности в клетки-мишени Т2 в течение 6 часов вводили 0,05 мг / мл пептида и 1 мкл Ки / лунку ³ H-тимидин (ICN Biomedical Inc., Ирвин, Калифорния).

После 20 дней культивирования эффекторные Т-клетки собирали без дальнейшего разделения для анализа микроцитотоксичности.Клетки были проанализированы с помощью проточной цитометрии, и 83 ± 10% из них были CD3 ⁺ и ∼45 или ∼60% из них были CD3 ⁺ CD8 ⁺ при праймировании sPSMA DC или tPSMA DC соответственно (данные не показано).

Для экспериментов по ингибированию CTLA-4 Fab-фрагменты, полученные (см. Ниже) из моноклонального антитела против CD152 (HB-12319, ATCC), добавляли (конечная концентрация 0,02 мг / мл) к Т-клеткам в начале культуры или через 6, 10 или 18 часов после этого. Культуры инкубировали в течение трех дополнительных дней, клетки промывали и ресуспендировали в среде AIV-M, содержащей IL-2 и IL-7.

Получение Fab-фрагмента моноклональных антител против CD152

Очищенный IgG (2 мг / мл в PBS) расщепляли папаином (Sigma) в соотношении 1:25 (мас. / Мас.) Папаина к IgG в присутствии 0,01 мМ L-цистеина при 37 ° C в течение 5,5 часов. Реакцию останавливали добавлением N -этилмалеимида до конечной концентрации 30 мМ. Фрагмент Fab выделяли гель-фильтрацией на колонке Superdex 75 (Pharmacia) с последующей хроматографией на ионообменной колонке (ResourceQ, Pharmacia).Буфер для элюированного белка заменяли на 10 мМ Трис-HCl (pH 7,4) гель-фильтрацией, и объединенный белок концентрировали до 15 мг / мл с помощью центрикона-10 (Millipore). Белок проверяли на чистоту на каждой стадии с помощью SDS-PAGE в восстановленных и невосстановленных условиях.

Тестирование цитотоксичности

Цитотоксичность против клеток LNCaP или против пептидно-импульсных T2-клеток (оба HLA-A2-положительных) тестировали через 20 дней культивирования и сравнивали с контрольной линией клеток, которая не экспрессировала PSMA.Цитотоксичность проверяли с помощью теста JAM. ²⁵ Вкратце, клетки-мишени или контрольные клетки выращивали в течение ночи с ³ H-тимидином, затем промывали, ресуспендировали в полной среде RPMI-1640 и использовали в 4-часовом тесте на цитотоксичность. Убийство было обнаружено как уменьшение числа клеток в минуту в образцах клеток, подвергающихся апоптозу из-за фрагментации ДНК. Все отношения E: T тестировали в трех повторностях. Спонтанную цитотоксичность определяли только в среде без эффекторных клеток.

Немеченые клетки K562 (без экспрессии MHC, чувствительные к лизису, опосредованному естественными клетками-киллерами) включали в 50-кратном количестве клеток-мишеней для ингибирования неспецифического лизиса. В контрольных экспериментах использовалась линия клеток меланомы Malme M3, которая также является HLA-A2-положительной.

Клеточные линии

Клеточные линии LNCaP (CRL-1740), T2 (CRL-1992), K562 и Malme 3M (HTB-64) человека были приобретены в ATCC и содержались в соответствии с инструкциями ATCC.

Анализ проточной цитометрии и использованные антитела

Антитела, используемые для фенотипирования клеток, были анти-CD1a, анти-HLA-DR-PE, анти-CD80-PE, анти-CD86-PE, анти-CD83-FITC, анти-CD54 -PE, анти-HLA-ABC-FITC, анти-CD14-FITC, анти-CD8-PE, анти-CD4-PE, анти-CD69-FITC (PharMingen, Сан-Диего, Калифорния) и анти-CD3-PerCP (Becton Дикинсон, Сан-Хосе, Калифорния).Для типирования HLA-A2 аликвоты мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) здоровых доноров тестировали с меченным FITC анти-HLA-A2 антителом BB7.2 (Becton Dickinson). Для окрашивания 10 ⁵ клеток суспендировали в 100 мкл мкл PBS 1% BSA и инкубировали с 10 мкл мкл антител в течение 20 минут на льду. Анализ проточной цитометрии выполняли на FACS-Calibur (Becton Dickinson).

Цитокинов и

³ H-тимидин

GM-CSF был приобретен у Oncology Supplies Inc.(Dothan, AL), IL-4 и IL-7 от PeproTech Inc. (Rocky Hill, NJ) и IL-2 и TNF- α от Becton Dickinson Inc. (Бедфорд, Массачусетс). ³ H-тимидин был приобретен в ICN Biomedical Inc. (Ирвин, Калифорния).

Статистика и предсказания связывания эпитопа

Анализ данных цитотоксичности проводили с использованием двусторонних тестов Стьюдента t , предполагая равную дисперсию. Мы использовали алгоритм прогнозирования из отдела биоинформатики и молекулярного анализа Национального института здоровья («BIMAS»), который был разработан Parker et al., ²⁶ , ранжируя потенциальные связывающие вещества MHC согласно прогнозируемой диссоциации комплексов пептид / MHC за половину времени. .

Синтез и очистка пептидов

Пептиды были индивидуально синтезированы и очищены Sigma Genosys (The Woodlands, TX).

(PDF) EuroFlow стандартизация настроек инструментов проточного цитометра и протоколов иммунофенотипирования

гематологических злокачественных новообразований, которые потенциально могут быть использованы в качестве эталона

в любой лаборатории по всему миру.

До сих пор стандартизация проточной цитометрии в гематологических

диагностических процессах остается сложной задачей и редко достигается в

в условиях нескольких учреждений.Были предприняты некоторые попытки

стандартизировать анализ минимальной остаточной болезни в нескольких

исследовательских группах

9,59–61

, которые ограничили стандартизацию на аналитическом этапе

путем обмена файлами данных в режиме списка. Kraan et al.

62

представили общие правила настройки цитометра в клинических условиях

с использованием аналоговых проточно-цитометрических систем с количеством цветов до четырех,

, тогда как Shankey et al.

63

представила полную стандартизацию

4-цветного исследования ZAP-70 в трех учреждениях. Наше настоящее исследование

выходит за рамки ранее опубликованных многоцентровых исследований, а

направлено на стандартизацию данных до уровня, на котором файлы listmode

, измеренные во всех центрах, могут быть метаанализированы с помощью программных средств

специально разработан для этой цели. Весь процесс настройки цитометра

, настроек компенсации, выбора флуорохромов

и выбора панели антител был переоценен и полностью контролировался.

Необходимость в такой обширной стандартизации возникает из

возможностей, которые открываются трехцветными цифровыми проточными цитометрами X8

для измерения все более детализированных подмножеств в сложных

клеточных образцах. Считается, что определения клеток с использованием 44 цветов для

повышают точность обнаружения редких клеток, например, для

исследований минимальных остаточных заболеваний. Анализ поверхностных / цитоплазматических паттернов экспрессии

на больших когортах образцов с помощью вычислительных инструментов

возможен только в том случае, если входные данные предоставлены в полностью стандартизованном формате

.Обмен знаниями и диагностика

редких заболеваний станут возможными с помощью ручного или компьютерного анализа

файлов данных, полученных в результате сотрудничества между учреждениями.

Здесь опять же, соответствующая интерпретация данных возможна только при использовании стандартизированных настроек и элементов управления прибора, при обеспечении качества данных

, а также при оценке и учете эффективности панелей антител

во время анализ.

Мы пришли к выводу, что 6 лет обширных совместных экспериментов

и анализа сотен образцов пациентов

в центрах EuroFlow действительно предоставили инновационные протоколы

, программные инструменты и панели антител для полностью стандартной диагностики. и классификация гематологических злокачественных новообразований.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Консорциум EuroFlow — это независимый научный консорциум, цель которого

— инновации и стандартизация диагностической цитометрии потока.Все полученные знания

и опыт будут переданы научному и диагностическому сообществу после

защиты соответствующей интеллектуальной собственности, например, путем подачи патентов.

задействованных патентов являются коллективной собственностью Консорциума EuroFlow, а доходы от

патентов используются исключительно для деятельности Консорциума EuroFlow, например, для

, покрывающих (частично) расходы на встречи Консорциума, EuroFlow Educational

Мастерские и покупка реагентов на заказ для коллективных экспериментов.

Cytognos — это коммерческая компания, разрабатывающая программное обеспечение Inficyt.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарны д-ру Жан-Люку Санне из Европейской комиссии за его поддержку

и мониторинг проекта EuroFlow. Мы благодарим Марике Команс-Биттер за графическое оформление фигур

и ее постоянную поддержку в управлении консорциумом

EuroFlow, а также Биби ван Бодегом, Кэролайн Линкер и Моник ван

Россум за их секретарскую поддержку консорциума виды деятельности.Мы благодарны

Риа Блумберг и Геллофу ван Стенису за поддержку в финансовом управлении фондами проекта

. Исследовательская деятельность Консорциума EuroFlow была поддержана

Европейской Комиссией (грант STREP EU-FP6, LSHB-CT-2006-018708, озаглавленный «Цитометрия Flow

для быстрой и точной диагностики и последующего наблюдения гематологических

злокачественных новообразований. ‘) и следующие национальные гранты: Испанская сеть онкологических центров

исследовательских центров (ISCIII RTICC-RD06 / 0020/0035-FEDER), FIS 08/ от’ Fondo

de Investigacio

´n Sanitaria ‘, Ministerio de Ciencia e Innovacio

´n (Мадрид, Испания), SA016-

A-09 от Consejerı

´a de Educacio

´n, Junta de Castilla y Leo

´n, Вальядолид, Испания,

и PIB2010BZ-00565 от Дирекции

´n General de Cooperacio

´n Internacional y

Relaciones Institucionales, Secretarı

´a de Estado de Investigacio

´0003,

´0003 n (Мадрид, Испания). Т. Калина, Э. Мейстрикова и О. Хрусак получили

при поддержке гранта № MSM0021620813 Министерства образования Чехии, грант Министерства здравоохранения Чехии

NT / 12425-4, а TK поддерживается в качестве стипендиата ISAC Международным обществом

. Развитие цитометрии.

ССЫЛКИ

1 Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H et al. Классификация ВОЗ

катион опухолей кроветворных и лимфоидных тканей. 4-е изд. International

Агентство по изучению рака: Лион, 2008, 439 стр.

2 Дэвис Б. Х., Холден Дж. Т., Бене М. К., Боровиц М. Дж., Брайлан Р. К., Корнфилд Д. и др.

Рекомендации Bethesda International Consensus по цитометрии потока

Иммунофенотипический анализ гематолимфоидной неоплазии: медицинские показания.

Cytometry B Clin Cytom 2007; 72 (Дополнение 1): S5 – S13.

3 Wood BL, Arroz M, Barnett D, DiGiuseppe J, Greig B, Kussick SJ et al. Bethesda

Рекомендации Международного консенсуса по иммунофенотипическому анализу гематолимфоидной неоплазии

с помощью проточной цитометрии: оптимальные реагенты и отчетность для

проточной цитометрической диагностики неоплазии кроветворения. Цитометрия B Clin Cytom

2007; 72 (Дополнение 1): S14 – S22.

4 Стюарт С.К., Бем Ф.Г., Кэри Дж.Л., Корнблит Дж., Дуке Р.Э., Хадналл С.Д. и др.

Консенсусные рекомендации США и Канады по иммунофенотипическому анализу

гематологической неоплазии методом проточной цитометрии: выбор комбинаций антител.

Cytometry 1997; 30: 231–235.

5 Stetler-Stevenson M, Ahmad E, Barnett D, Braylan R, DiGiuseppe J, Marti G et al.

Клинический проточный цитометрический анализ неопластических гематолимфоидных клеток.Утверждено руководство

. 2-е изд. Документ CLSI h53-A2 изд. Клинические и лабораторные стандарты

Институт: Wayne, PA, 2007.

6 Perfetto SP, Chattopadhyay PK, Roederer M. Семнадцатикрасочная цитометрия:

раскрывает иммунную систему. Nat Rev Immunol 2004; 4: 648–655.

7 Баумгарт Н., Родерер М. Практический подход к многоцветной цитометрии для иммунофенотипирования

. J Immunol Methods 2000; 243: 77–97.

8 Craig FE, Foon KA.Проточно-цитометрическое иммунофенотипирование гематологической плазмы neo-

. Кровь 2008; 111: 3941–3967.

9 van de Loosdrecht AA, Alhan C, Bene MC, Della Porta MG, Drager AM, Feuillard J

et al. Стандартизация цитометрии потока при миелодиспластических синдромах: отчет

с первой рабочей конференции European LeukemiaNet по цитометрии потока при миелодиспластических синдромах

. Haematologica 2009; 94: 1124–1134.

10 Rawstron AC, Orfao A, Beksac M, Bezdickova L, Brooimans RA, Bumbea H et al.

Отчет Европейской сети миеломы о многопараметрической цитометрии потока в

множественной миеломе и родственных заболеваниях. Haematologica 2008; 93: 431–438.

11 Руис-Аргуэльес А., Риваденейра-Эспиноза Л., Дуке Р. Э., Орфао А. Отчет о

второй латиноамериканской конференции по консенсусу по потоковому цитометрическому иммунофе-

— выявление гематологических злокачественных новообразований. Цитометрия B Clin Cytom 2006; 70: 39–44.

12 Оуэнс М.А., Валл Х.Г., Херли А.А., Вормсли С.Б.Валидация и контроль качества иммунофенотипирования

в клинической цитометрии потока. J Immunol Methods 2000; 243: 33–50.

13 Дэвис Б. Х., Фукар К., Щарковский В., Болл Э, Витциг Т., Фун К. А. и др. US-Canadian

Консенсусные рекомендации по иммунофенотипическому анализу гематологической неоплазии

методом проточной цитометрии: медицинские показания. Cytometry 1997; 30: 249–263.

14 Bene MC, Nebe T., Bettelheim P, Buldini B, Bumbea H, Kern W. et al. Иммуно-

фенотипирование острого лейкоза и лимфопролиферативных заболеваний: согласованное предложение

рабочего пакета European LeukemiaNet 10.Лейкемия 2011 г .; 25:

567–574.

15 Манке Ю.Д., Родерер М. Оптимизация анализа многоцветного иммунофенотипирования.

Clin Lab Med 2007; 27: 469–485.

16 Roederer M, Kantor AB, Parks DR, Herzenbergzzz LA. Cy7PE и Cy7APC: яркие

новых зондов для иммунофлуоресценции. Cytometry 1996; 24: 191–197.

17 Мац М.В., Фрадков А.Ф., Лабас Ю.А., Савицкий А.П., Зарайский А.Г., Маркелов М.Л. и др.

Флуоресцентные белки небиолюминесцентных видов Anthozoa.Nat Biotechnol

1999; 17: 969–973.

18 Берлиер Дж. Э., Роте А., Буллер Дж., Брэдфорд Дж., Грей Д. Р., Филаноски Б. Дж. И др. Количественное сравнение

длинноволновых красителей Alexa Fluor и красителей Cy: флуоресценция красителей

и их биоконъюгатов. J Histochem Cytochem 2003; 51: 1699–1712.

19 Телфорд В., Капур В., Джексон Дж., Берджесс В., Буллер Г., Хоули Т. и др. Violet laser

диоды в проточной цитометрии: обновление. Cytometry A 2006; 69: 1153–1160.

20 Абрамс Б., Диву З., Гурьев О., Алешков С., Хингорани Р., Эдингер М. и др. 3-Карбокси-

6-хлор-7-гидроксикумарин: высокофлуоресцентный водорастворимый фиолетово-возбудимый краситель

для клеточного анализа. Анальная биохимия 2009; 386: 262–269.

21 Maecker H, Trotter J. Выбор реагентов для многоцветной проточной цитометрии. Заявка

Примечание. BD Biosciences: Сан-Хосе, Калифорния, 2009.

22 Стюарт С.К., Стюарт С.Дж.. Четыре компенсации цвета. Cytometry 1999; 38: 161–175.

23 Roederer M. Спектральная компенсация для цитометрии потока: артефакты визуализации,

ограничения и предостережения. Cytometry 2001; 45: 194–205.

24 Maecker HT, Frey T, Nomura LE, Trotter J. Выбор конъюгатов флуорохромов для максимальной чувствительности

. Cytometry A 2004; 62: 169–173.

25 Wood B. 9-цветная и 10-цветная цитометрия в клинической лаборатории. Arch Pathol

Lab Med 2006; 130: 680–690.

EuroFlow стандартизация протоколов цитометрии потока

T. Kalina et al.

2009

и 2012 Macmillan Publishers Limited Leukemia (2012) 1986 — 2010

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

терапевтических решений Международный побочный проект Campbell Neurosciences демонстрирует предварительную эффективность первого анализа крови для определения зависимости от азартных игр: Kaihani Score ™

Bloomberg

Трубопроводы заблокированы, когда в 2012 г. прекратилось предупреждение о взломе «мигающим красным»

(Bloomberg) — Десять лет назад, после того, как хакеры были пойманы на проникновении в газопроводы, появилось видео Аль-Каиды, призывающее к «электронному джихаду» против США.С. Инфраструктура, тогдашний сенатор Джозеф Либерман попытался бить тревогу. Система «мигает красным», — предупредил Либерман своих коллег в Сенате во время дебатов об угрозе в 2012 году. Сегодняшний день станет целью вражеской атаки ». Во главе с независимым и бывшим кандидатом в вице-президенты Коннектикута законодатели стремились потребовать от энергетических компаний усиления компьютерной безопасности. Но усилия пошли на убыль из-за яростного лоббирования со стороны нефтяных компаний и других корпоративных интересов, которым удалось отменить законодательство.Это оставило в силе систему добровольных руководящих принципов, которые не смогли остановить атаку программ-вымогателей в прошлом месяце на компанию Colonial Pipeline Co., которая парализовала главную топливную артерию на восточном побережье. «Это действительно упущенная возможность, — сказал Либерман, ныне старший советник в ТОО «Касовиц Бенсон Торрес». «Атака на колониальный трубопровод, возможно, не произошла, если бы мы приняли закон». Теперь, в ответ на нападение, Министерство внутренней безопасности готовится отказаться от добровольного подхода и наложить требования кибербезопасности на трубопроводы, по словам знакомого человека. с планами, которые просили не называть их имени до официального объявления.Это было бы поражением для нефтяных компаний и операторов трубопроводов, которые на протяжении более десяти лет успешно боролись с федеральными стандартами, чтобы предотвратить кибератаки со стороны законодательства или регулирующих органов. В отличие от электростанций, трубопроводы США не обязаны выполнять какие-либо федеральные требования к кибербезопасности, даже несмотря на то, что Служба национальной безопасности получила полномочия вводить их, когда она была создана после атак 11 сентября 2001 года. Управление транспортной безопасности, DHS Агентство, отвечающее за защиту национальных трубопроводов, на этой неделе выпустит директиву, требующую от трубопроводных компаний сообщать о киберинцидентах, по словам человека, знакомого с планами.Дополнительные требования к защите объектов и реагированию на нападения будут выдвинуты в ближайшие недели, сообщает Washington Post. «Администрация Байдена предпринимает дальнейшие действия для повышения безопасности критически важной инфраструктуры нашей страны», — говорится в заявлении DHS во вторник. «Мы опубликуем дополнительную информацию в ближайшие дни». До сих пор TSA сопротивлялась использованию своих полномочий для принятия мер киберзащиты. «Я полагал, что мы могли бы получить более быструю и лучшую безопасность, работая с отраслью, вместо того, чтобы регулировать их, потому что правила устанавливают минимальные стандарты безопасности, и промышленность во многих случаях делала больше, — сказал Джек Фокс, который до выхода на пенсию в 2016 году занимал должность менеджера агентства по безопасности трубопроводов.Законопроект Либермана установил бы требования к кибербезопасности для частной критически важной инфраструктуры и наложил бы штрафы на компании, которые этого не сделали. Правила применялись бы не только к трубопроводам: должны были быть включены секторы, в которых враждебный отказ компьютерных систем может привести к массовым жертвам, краху финансовых рынков или перебоям в подаче энергии и воды. Сниженная версия законопроекта не смогла преодолеть возглавляемого республиканцами пирата. Трубопроводные компании Для Либермана неудача все еще болезненна.«Мы бы как бы спросили себя, кто движет этой агрессивной оппозицией, и ответ, который мы получили, — это энергетические компании и трубопроводные компании», — сказал он. Каждая крупная нефтяная компания США, включая Exxon Mobil Corp., Chevron Corp. и ConocoPhillips — лоббировали законодательство вместе с некоторыми нефтеперерабатывающими предприятиями и как минимум с одним оператором трубопровода. Согласно формам раскрытия информации, поданным в Конгресс, Colonial не лоббировала эту меру в 2012 году. Однако группы, к которым он принадлежал, сделали, в том числе Американский институт нефти, Ассоциацию нефтепроводов и Торговую палату — политический титан, который сообщил о затратах 103 долларов.9 миллионов человек оказали влияние на политику правительства в 2012 году. Палата выступила против закона в то время, назвав его слишком широким и жестким подходом к регулированию, который грозил создать «враждебные» отношения между правительством и частным сектором вместо того, чтобы способствовать сотрудничеству в борьбе с кибератаками. . Группа поддержала альтернативный подход, направленный на более широкий обмен информацией об угрозах, позицию, которую она поддерживает и сегодня. «Мы поддерживаем государственно-частное сотрудничество, которое укрепляет нашу кибербезопасность во всех секторах, включая трубопроводы, на благо всех американцев», — сказал Мэтью Эггерс. , вице-президент Палаты по политике кибербезопасности.Эксперты по кибербезопасности и правительственные чиновники в течение многих лет предупреждали о последствиях взлома трубопровода, в том числе в 2019 году, когда Управление директора национальной разведки опубликовало отчет, предупреждающий, что кибератака может нарушить работу трубопровода «на несколько дней или недель». Широкое противодействие со стороны бизнеса законопроекту Либермана, с почти всеми затронутыми отраслями, от финансовых услуг до связи, вовлечение, чтобы предупредить, что предлагаемые мандаты кибербезопасности вставят тяжелую руку правительства в корпоративные дела.Но сторонники предупредили, что мандаты необходимы для обеспечения достаточных гарантий на фоне шквала все более изощренных атак на частные компании, управляющие электростанциями, плотинами и другой критически важной инфраструктурой. Al-Qaeda VideoWeeks после внесения законопроекта, предупредило Министерство внутренней безопасности хакеры потратили месяцы, пытаясь проникнуть в компьютерные системы ряда операторов газопровода. ABC News сообщило, что ФБР получило видеозапись Аль-Каиды, призывающую к «электронному джихаду» против У.С. критическая инфраструктура. А компания по компьютерной безопасности McAfee Corp. предупредила о скоординированных продолжающихся кибератаках на мировые энергетические компании в 2011 г. Эпизоды взлома предвещали, насколько привлекательными являются системы доставки топлива для киберпреступников, таких как связанная с Россией группа, которая использовала вымогатель DarkSide для удержания компьютерных систем Colonial. заложник около 7 мая. Компания была вынуждена закрыть свою трубопроводную систему протяженностью около 5 500 миль (8 851 километр), которая обеспечивает около 45% топлива, используемого на Восточном побережье, что привело к отключениям на заправочных станциях и выплата выкупа в размере 5 миллионов долларов до возобновления обслуживания через пять дней. Неясно, предотвратили бы нападение санкции, но расследование все еще продолжается. Colonial пообещал «рассмотреть любое предложение, основанное на уроках, извлеченных из этого события, которое укрепляет или укрепляет нашу инфраструктуру». Группы по торговле нефтью и трубопроводом упорно настаивают, что сейчас не время для предписывающих федеральных мандатов. «Любое обсуждение регулирования преждевременно, пока мы не получим его. полное понимание деталей, связанных с колониальной атакой », — сказала Сюзанна Лемье, менеджер API по безопасности операций и реагированию на чрезвычайные ситуации.«Но мы полны решимости продолжать нашу надежную координацию со всеми уровнями правительства». Торговая ассоциация добавила в своем заявлении, что в 2012 году она в целом была согласована с Палатой по данному вопросу, и предостерегла от предписывающего универсального подхода к регулированию, который это было бы контрпродуктивным. Джон Стоди, представитель Ассоциации нефтепроводов, в состав которой входит Colonial Pipeline, сказал: «Мы хотим, чтобы TSA выполняла все, что они планируют сделать». «Например, слишком широкое требование к отчетности может подавлять TSA сотнями тысяч сообщений о кибератаках каждый день, которые никому не принесут никакой пользы », — сказал он.В заявлении PartnershipChevron по электронной почте говорится, что федеральное регулирование «должно использовать подход, основанный на оценке риска», который дает компаниям гибкость в защите от угроз. И Exxon отметила, что быстрое развитие киберугроз означает, что «любые формальные и предписывающие требования кибербезопасности для отрасли часто устаревают после завершения». Администрация транспортной безопасности давно придерживается аналогичного подхода. Как следует из презентации, размещенной на веб-сайте агентства, в прошлом году руководитель филиала в офисе наземных операций агентства хвастался, что в нем задействовано «очень мало правил» и «совместный подход к отраслевым мерам безопасности».TSA решила не регулировать сектор трубопроводов, потому что, по его мнению, партнерство с промышленностью было более эффективным, сказал Фокс, отставной менеджер TSA по безопасности трубопроводов. «На изменение нормативных требований уходят месяцы или годы, — сказал Фокс в телефонном интервью. «Благодаря этому партнерству мы могли бы позвонить по телефону и сказать, что нам нужно, чтобы вы сделали то-то и то-то, и на это отреагируют на следующий день». Республиканский FilibusterFox сказал, что не думает, что законопроект Либермана предотвратил бы колониальную кибератаку ». Вы можете регулировать все, что захотите, — сказал Фокс.«У нас есть правила по ограничению скорости, контролю над оружием и тому подобному, поэтому, если вы что-то регулируете, это не означает, что этого не произойдет». В конечном итоге в 2012 году Либерман и Коллинз смягчили свой счет в отчаянной попытке победить республиканцев. чтобы это прошло. Они отказались от мандатов и штрафов в пользу меры, которая предусматривала бы только необязательные требования, но даже сокращенного счета было недостаточно. Сохраняющиеся опасения по поводу ответственности и неприкосновенности частной жизни преследовали закон, и Палата также выступила против новой версии. Она дважды терпела поражение от флибустьера, возглавляемого республиканцами, и в итоге потерпела поражение на девять голосов из 60, необходимых для прекращения дебатов в ноябре 2012 года. Эми Майерс Джаффе, профессор Университета Тафтса и автор книги «Цифровое будущее энергетики», сказала, что колониальная кибератака может быть «моментом Макондо» для трубопроводной отрасли. Это отсылка к нефтяной скважине в Мексиканском заливе, которая взорвалась в 2010 году, в результате чего погибли 11 рабочих и произошел самый серьезный разлив нефти в истории США. за участие в катастрофе, сказал Джефф.«Меня шокирует мысль, что отрасль, которая любит хвастаться своими показателями безопасности, когда-либо лоббировала против введения государственных стандартов, которые являются обязательными для кибербезопасности в жизненно важной энергетической инфраструктуре». Больше подобных историй можно найти на bloomberg. comПодпишитесь сейчас, чтобы оставаться впереди самого надежного источника деловых новостей. © 2021 Bloomberg LP

Текущие проблемы и перспективы на будущее в исследованиях перорального поглощения: мнение сети UNGAP

Ключевые слова

Конкретные группы пациентов

Региональные различия

Продвинутый составы

Аморфные твердые дисперсии

Составы на основе липидов

Взаимодействие пищевых продуктов и лекарств

Микробиом

In vitro инструменты

Моделирование PBPK

Список сокращений

A / V

Отношение объема абсорбции

Поверхность абсорбции

Ангиотензинпревращающий фермент 2

AhR

Арилуглеводород r рецептор

AMI

Вставка искусственной мембраны

ASD

Аморфные твердые дисперсии

BCS

Биофармацевтическая система классификации

CAR

Конститутивный рецептор андростана

C _max

Максимальная концентрация в плазме

COVID-19

Coron000

Проникающая болезнь клеток

CVRM

Кариесосудистые, почечные и метаболические заболевания

CYP

Ферменты цитохрома P450

DDI

Лекарственные взаимодействия

DLin-MC3-DMA

Гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4- (диметиламино) бутаноат

DWS

Спектроскопия диффузных волн

EMA

Европейское агентство по лекарственным средствам

СОЭ

Исследователь на ранних стадиях

FDA

U. S. Пищевые продукты и лекарственные препараты

FTIR

Инфракрасное преобразование Фурье

GalNac

N-ацетилгалактозамин

GIT

Желудочно-кишечный тракт

GLP-1

Глюкагоноподобный пептид 1

GRAS

Общепризнанный безопасный

HDV 9000 vesicle

Hepatic-

Пары гидрофобных водородных связей

HIP

Гидрофобные ионные пары

ВИЧ

Вирус иммунодефицита человека

IBD

Воспалительное заболевание кишечника

IVIVR

In vitro-in vivo связь

LbDDS

Системы доставки лекарств на основе липидов

LLC-PK

LLC-PK

клетки почек свиньи

LUMI

Инжектор микроигл с разворачивающимся просветом

MDCK

Клетки почек собак Madin-Darby

МРТ

Магнитно-резонансная томография

NLC

Наноструктурированные липидные носители

NMR

Анализ ядерной магнитной проницаемости

000 Parallel ArAMPA

0003 Parallel ArAMPA Перенос малых аминокислот с помощью протонов ter

PBPK

Фармакокинетическая модель на физиологической основе

PSA

Анализ чувствительности к параметрам

PVDF

Поливинилиденфторид

PVPA

Анализ проницаемости на основе фосфолипидных везикул

PWSD

Плохо растворимые в воде препараты

000 Ренин

000 Ренин

000 РАН SARS-CoV-2

Тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2

SAXS

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

SLN

Твердые липидные наночастицы

SNAC

N- [8- (2-гидроксибензоил) амино] каприлат

SNEDDS

Самоэмульсификация системы доставки лекарств

SNP

Однонуклеотидный полиморфизм

SOMA

Самоориентирующийся аппликатор миллиметрового масштаба

TDC

Тирозиндекарбоксилазы

TIM

TNO (желудочно-кишечный тракт)

TPE

Временный усилитель проницаемости

TocGopS суксил

TocGopS

TocGopS Уридин-5′-дифосфоглюкуронозилтрансфераза

UNGAP

евро Сеть специалистов по изучению процессов, связанных с желудочно-кишечной абсорбцией

USP

Фармакопея США

Lear Corporation — MarkLines Automotive Industry Portal

ноябрь. 1993	Приобретены некоторые активы компании Ford Motor Co., занимающейся пластмассовыми изделиями и отделкой, которая поставляет компании Ford обшивку сидений и сиденья в сборе.
декабрь 1993	Слияние с материнской компанией Lear Holdings Corporation с образованием нового предприятия.
декабрь 1994	Приобретение SEPI S.p.A. у Gilardini S.p.A.
июнь 1995	Приобретено примерно 97% Masland Corporation. Создано совместное предприятие Lear Seating Inespo Industrial Do Brasil L.T.D.A. в Бразилии.
Август 1995	Приобретена компания Automotive Industries Holding, Inc.
Октябрь 1995 г.	Создано совместное предприятие Lear Seating Do Brasil в Бразилии.
декабрь 1996	Приобретение Borealis Industrier AB, западноевропейского поставщика приборных панелей, дверных панелей и других автомобильных компонентов, у Borealis Holding AB.
июнь 1997	Приобретена компания Dunlop Cox Limited.
июль 1997	Приобретены определенные доли участия и партнерства в компании Keiper Car Seating GmbH & Co. и некоторых ее дочерних и зависимых компаниях.
Август 1997	Приобретено подразделение автомобильных подсистем сидений компании ITT Automotive.
Сентябрь 1998 г.	Приобретен бизнес по производству сидений Delphi Automotive Systems.
февраль 1999 г.	Приобретение Polovat и автомобильного бизнеса Ovatex.
апр. 1999	Приобретены некоторые активы Peregrine Windsor, Inc., подразделения Peregrine Incorporated.
Май 1999	Приобретена компания UT Automotive Inc., операционный сегмент, полностью принадлежащий United Technologies Corporation.
июнь 1999	Проданы электрические моторные системы (EMS) компании Johnson Electric Holdings Limited.
Сентябрь 1999 г.	Приобретена 50% -ная доля Donnelly Corporation в Lear-Donnelly Overhead Systems, L.L.C., совместном предприятии, в котором два поставщика были партнерами.
Май 2000	Создано совместное предприятие с Motorola, Inc.
июнь 2000	Продал свой бизнес по производству герметиков и поролона компании AcoustiSeal.
ноябрь 2000	Образовано Total Interior Systems — America, совместное предприятие с Takashimaya Nippatsu Kogyo Co., ООО
декабрь 2000	Продано четыре европейских завода по производству пластика и металла.
2000	Продал свои доли в North American Interiors, L. L.C., Pianfei Glass S.A., Autoform Kunstoffteile GmbH и Autoform Kunstoffteile GmbH & Co. KG.
фев 2002	Создал комплексное деловое партнерство с Mitsubishi Cable Industries, Ltd. в сфере автомобильных жгутов проводов.
Апрель 2002	Объявлено о создании Nanjing Lear Xindi Automotive Interiors System Co., Ltd. (Lear Xindi), совместного предприятия с дочерней компанией Xindi Yuejin Motor Group Corporation.
2006	Решил уйти из интерьерного бизнеса и завершил продажу европейского интерьерного бизнеса.
Март 2007 г.	Завершила продажу своего интерьерного бизнеса.
июл 2009	Компания вместе с некоторыми дочерними компаниями в США и Канаде подала заявление о защите от банкротства согласно Главе 11.
ноя 2009	Компания вышла из защиты от банкротства по главе 11.
Май 2012	Приобретена компания Guilford Mills, производитель тканей для автомобильного и специализированного рынков.
Январь 2015 г.	Приобретена компания Eagle Ottawa, производитель автомобильной кожи, за 850 миллионов долларов США.
Август 2015	Приобретены интеллектуальная собственность и технологии у Autonet Mobile, разработчика программного обеспечения и устройств для автомобильных приложений.
ноя 2015	Приобретена компания Arada Systems, занимающаяся автомобильными технологиями, которая специализируется на коммуникациях V2V и V2I.
Декабрь 2016	Приобретена AccuMED Holdings Corp., частный разработчик и производитель специализированных тканей.
Апрель 2017	Завершено приобретение бизнеса по производству сидений Grupo Antolin за 286 миллионов евро. No related posts. Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт