Как поменять воздушный фильтр на лада гранта: Замена воздушного фильтра на Лада Гранта: фото и видео

Рахул Рой

¹ Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр биофизики и вычислительной биологии Университета Illinois at Urbana-Champaign, 1110 West Green Street, Urbana, Illinois 61801, USA

Sungchul Hohng

³ Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, San 56-1 Sillim 9-dong, Gwanak-gu, Seoul 151-747, Корея

Taekjip Ha

¹ Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр Биофизика и вычислительная биология, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

¹ Департамент физики Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр биофизики и вычислительной биологии, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

³ Кафедра физики и астрономии, Сеульский национальный университет, Сан 56-1 Силлим 9-донг, Кванак-гу, Сеул 151-747, Корея

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 Запад Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы: Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассирования поверхности полиэтиленгликоля (PEG 9000)

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

GUID: 2C6897D7-8368-4C8B-A944-5AA7DB5A00BA

Реферат

Несмотря на взрывной рост биологических применений методов одиночных молекул за последнее десятилетие методы до сих пор практиковались в основном исследователями, ориентированными на биофизику.Отчасти это происходит из-за отсутствия коммерческих инструментов во многих случаях, а также из-за воспринимаемой крутой кривой обучения и необходимости в дорогостоящем оборудовании. Мы хотим предоставить практическое руководство по использованию резонансной передачи энергии (FRET) Фёрстера (или флуоресценции) на уровне отдельных молекул, уделяя особое внимание изучению иммобилизованных молекул, которые позволяют измерять траектории реакции отдельных молекул от 1 миллисекунды до многих минут. Прибор может быть построен по разумной цене с использованием различных готовых компонентов и надежно эксплуатироваться с использованием текущих общепринятых протоколов и свободно доступного программного обеспечения.

Будущее открывает перспективы персонализированного секвенирования ДНК и высокопроизводительного скрининга на патогены по доступной цене и в разумное время. Эти обещания подкрепляются всплеском технологий на основе одиночных молекул, которые позволяют нам манипулировать и исследовать отдельные молекулы. Используя этот подход, перед микроскопом предстает несколько важных биологических загадок, которые долгое время интересовали ученых. Как сказал Фейнман, «очень легко ответить на многие из этих фундаментальных биологических вопросов; вы просто посмотрите на вещь ! » ¹ .Одномолекулярные методы позволяют нам делать именно это ^{2, 3} . Однажды они могут стать элементарным инструментом для характеристики белков, сигнальных путей или любого биологического явления. В надежде способствовать достижению этой цели, мы предлагаем краткое, но практическое руководство по измерениям одиночных молекул FRET ⁴ (smFRET) ^5-7 , одному из наиболее общих и адаптируемых методов измерения одиночных молекул. С момента своего скромного зарождения в неводных условиях в 1996 г. ⁸ smFRET быстро развился, чтобы ответить на фундаментальные вопросы о репликации, рекомбинации, транскрипции, трансляции, сворачивании и катализе РНК, неканонической динамике ДНК, сворачивании белков и конформационных изменениях, различных моторные белки, белки слияния мембран, ионные каналы, трансдукция сигналов, и это лишь некоторые из них, и этот список продолжает расти быстрыми темпами.Поскольку целью данного обзора не является обзор обширной литературы по таким исследованиям, мы отсылаем читателя к обзорам в данной области и ссылкам в них ^{6, 9-13} .

В измерениях FRET степень безызлучательного переноса энергии между двумя молекулами флуоресцентного красителя, называемыми донором и акцептором, сообщает о промежуточном расстоянии, которое можно оценить по отношению акцептора к общей интенсивности излучения () ^{4, 14, 15} . Эта эффективность передачи энергии, E , задается как E = [1 + ( R / R ₀ ) ⁶ ] ^-1 , где R — расстояние между красителями. и R ₀ — это радиус Ферстера, при котором E = 0.5 (). Конформационную динамику отдельных молекул можно наблюдать в режиме реального времени, отслеживая изменения FRET (). Преимущество метода FRET заключается в том, что он является логометрическим методом, позволяющим нам измерять внутреннее расстояние в молекулярном каркасе, а не в лабораторном, и, следовательно, делает его в значительной степени невосприимчивым к инструментальным шумам и дрейфу. Измерение FRET свободно диффундирующих одиночных молекул проще в реализации (коммерческие решения также доступны, например, MicroTime200 от PicoQuant) и эффективно для выявления распределения популяций расстояний между красителями ^16-19 .Однако возможность контролировать отдельные молекулы в течение длительного периода времени добавляет совершенно новое измерение с динамической информацией в диапазоне от миллисекунд до минут. Хотя можно использовать конфокальную микроскопию ^{20, 21} , временные траектории smFRET чаще всего получают путем визуализации поверхностных иммобилизованных молекул с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIR), которая позволяет осуществлять высокопроизводительный сбор данных ^{5, 22} . Установки МДП были успешно адаптированы многочисленными группами и могут быть легко собраны в соответствии с пошаговой инструкцией ⁷ с использованием готовых компонентов, которые стоят примерно столько же, сколько ультрацентрифуга.Здесь мы рассматриваем этот метод FRET, а также предоставляем список поставщиков различных реагентов и оборудования, используемых в нашей лаборатории (дополнительные таблицы 1 и 2 в Интернете; перечисленные элементы и поставщики не являются единственными вариантами, и можно найти другие альтернативы). Все программы сбора и анализа данных находятся в свободном доступе в Интернете (http://bio.physics.uiuc.edu), а инструкции по подготовке пассивированной полимером поверхности и веб-ссылка на демонстрационные видеоролики включены в Дополнительный протокол в Интернете. Хотя мы в основном обсуждаем двухцветную схему FRET в этом обзоре, схемы FRET более высокого порядка могут также применяться для исследования многокомпонентных взаимодействий или пространственно-временных отношений между различными конформационными изменениями в больших молекулярных комплексах (Box 1).

Одномолекулярный FRET. ( a ) Эффективность FRET, E как функция расстояния между красителями ( R ) для R ₀ = 50 Å. Донорный краситель, непосредственно возбуждаемый падающим лазером, либо флуоресцирует, либо передает энергию акцепторному красителю в зависимости от его близости. При R = R ₀ , E = 0,5, а на меньших расстояниях> 0,5 и наоборот в соответствии с функцией, показанной синей линией. Обратите внимание на линейность значений E рядом с R ₀ .( b ) Пример двухцветных данных smFRET. Данные получают в виде интенсивностей донора и акцептора (верхняя панель), из которых вычисляется кажущаяся эффективность FRET (нижняя панель). Мутантный рибозим шпильки ⁹³ , который несет донор и акцептор на разных плечах одной и той же молекулы, претерпевает переходы между тремя состояниями FRET (E1, E2 и E3). Антикоррелированный характер донорного и акцепторного сигналов указывает на то, что эти изменения интенсивности происходят из-за передачи энергии.Молекулы красителя также показывают переходы в темное состояние, например. интенсивность акцептора временно падает до нуля (~ 9 с) или полностью фотообесцвечивается (~ 18,5 с).

Box 1

Схемы FRET

Однопарный FRET () — мощный метод, однако важно понимать, что глобальные конформационные изменения во время биомолекулярных взаимодействий, будь то сворачивание белка или взаимодействия белок-нуклеиновая кислота, редко бывают одномерными. В отсутствие кристаллических структур интерпретация изменений расстояния между красителями может быть согласована с несколькими различными, но не обязательно взаимоисключающими моделями.Следовательно, постоянно возрастает интерес к расширению досягаемости FRET до трех измерений. Здесь мы обсуждаем некоторые схемы FRET на начальной стадии или стадии разработки.

Трехцветная каскадная схема: Ограниченный диапазон расстояний FRET побудил исследователей использовать каскады кассет передачи энергии для увеличения эффективных значений R ₀ . Например, в трехцветном каскаде промежуточный акцептор энергии передает энергию, полученную от донора, акцептору более низкой энергии ().Эта схема может быть полезной при исследовании изменений в больших комплексах, таких как рибосомы или нуклеосомы.

Трехцветная бифуркатная схема: один краситель может действовать как донор для двух независимых акцепторов, которые можно спектрально разделить (). В зависимости от близости от любого из акцепторов донор гаснет с увеличением эмиссии соответствующего акцептора. Обратный подход был бы с двумя независимыми донорами (спектрально разделенными, но возбуждаемыми одной и той же длиной волны света), которые могут выборочно гасить в зависимости от того, какой из них находится рядом с единственным акцептором.

Общая трехцветная схема: В общем случае из двух вышеупомянутых будет ситуация, когда передача энергии между тремя красителями не ограничена, и, следовательно, необходимо провести подробные расчеты для оценки трех расстояний между красителями (). Это позволяет явно определить однозначную эталонную плоскость в трехмерном конформационном пространстве биомолекулы.

Схема с двумя парами FRET: для больших комплексов использование двух независимых пар FRET может сообщать о конформационных изменениях в отдельных областях макромолекулы в реальном времени ().Реализация таких схем будет зависеть от разработки более голубых красителей, которые могут действовать как эффективные доноры одиночных молекул.

Схемы FRET одиночных молекул.

Схема эксперимента

Одномолекулярные флуоресцентные красители

Идеальный флуорофор для исследований одиночных молекул должен быть ярким (коэффициент экстинкции, ε > 50000 M ⁻¹ см ⁻¹ ; квантовый выход, QY > 0,1 ), фотостабильный с минимальными фотофизическими / химическими эффектами и эффектами агрегации, небольшой и водорастворимый с достаточным количеством химикатов биоконъюгации.Кроме того, отличная пара smFRET должна иметь (1) большое спектральное разделение между излучением донора и акцептора и (2) аналогичные квантовые выходы и эффективность обнаружения. В то время как флуоресцентные белки использовались для исследований smFRET ²³ , низкая фотостабильность и фотоиндуцированное мигание препятствовали дальнейшим применениям. Полупроводниковые квантовые точки (КТ) также использовались в качестве донора smFRET ²⁴ за счет химического подавления их мерцания ²⁵ , но большой размер (диаметр> 20 нм для коммерческих КТ) и отсутствие схемы одновалентного сопряжения ограничивают их использование.Следовательно, самые популярные одномолекулярные флуорофоры — это небольшие (<1 нм) органические красители ²⁶ . Мы сравнили три пары FRET с оптической плотностью от 500 до 700 нм от разных производителей (цианиновые, Alexa- и Atto-красители) в. Хотя цианиновые красители (Cy3 и Cy5; донор и акцептор соответственно) долгое время были фаворитами, их аналоги кажутся сопоставимыми по своим соответствующим свойствам. Ни один из более голубых красителей, например те, которые можно возбуждать при 488 нм, не был столь фотостабильным. Замена Cy3 для синтеза пользовательской РНК, Dy547, даже более фотостабильна, чем Cy3 (Sua Myong, личное сообщение).Тетраметилродамин является жизнеспособной альтернативой и имеет почти такой же спектр, что и Cy3, но с более низким коэффициентом экстинкции. Однако он имеет тенденцию к спонтанному изменению своей интенсивности между тремя различными уровнями (неопубликованные наблюдения). Красители для ближнего инфракрасного диапазона, такие как Cy5.5 и Cy7, также служат эффективными однокомолекулярными красителями и могут использоваться в многоцветных схемах (обсуждается позже).

Таблица 1

Сравнение однокомолекулярных красителей FRET

Повышение фотостабильности

Состояние молекулярного кислорода для эффективного гасителя красителя также является источником высокореактивных форм кислорода, которые в конечном итоге вызывают фотообесцвечивание ²⁷ . Хотя удаление кислорода снижает фотообесцвечивание, оно увеличивает время пребывания в триплетном темном состоянии ²⁸ , вызывая миллисекундную или более длительную перемежаемость флуоресценции или раннее начало насыщения сигнала.Аналог витамина E под названием Trolox (2 мМ; 100 × исходный раствор, приготовленный в диметилсульфоксиде (ДМСО), требуется регулировка pH и фильтрация) является отличным гасителем триплетного состояния, который подавляет моргание и стимулирует длительное выделение популярных цианиновых красителей в сочетании с ферментативная система поглощения кислорода ²⁸ . Trolox также должен обеспечить значительное улучшение временного разрешения, поскольку он задерживает наступление насыщения излучения с увеличением интенсивности лазера. Восстановитель β-меркаптоэтанол (βME; 142 мМ) является менее эффективным гасителем триплетного состояния и вызывает долгоживущие темные состояния Cy5 ²⁸ , побочный эффект, который использовался для приложений фотопереключения со сверхвысоким разрешением ²⁹ .Существует множество других тушителей триплетного состояния или агентов против выцветания, которые могут оказаться полезными для нецианиновых красителей ³⁰ .

Самая популярная ферментативная система поглощения кислорода ³¹ представляет собой смесь глюкозооксидазы (165 Ед / мл), каталазы (2170 Ед / мл) и β-D-глюкозы (0,4% масс.) (Или 0,8% моногидрата декстрозы). Глюкозооксидазу необходимо добавить непосредственно перед визуализацией, а образец держать изолированным от воздуха, чтобы pH раствора не упал значительно из-за образования глюконовой кислоты, побочного продукта реакции.Другими вариантами могут быть комбинация протокатехуиновая кислота / протокатехуат-3,4-диоксигеназа ³² , которая обеспечивает ~ 40% улучшение по сравнению с предыдущим методом (Нильс Вальтер, личное сообщение). Если высокоочищенные формы этих ферментов коммерчески недоступны, необходимо позаботиться о том, чтобы гарантировать отсутствие загрязняющей активности, особенно рибонуклеаз.

Конъюгация

Если доступна структурная информация, места для маркировки должны быть выбраны так, чтобы расстояние между красителями изменилось с меньшего на большее, чем значение R ₀ (или наоборот ) для максимальной чувствительности.Существуют некоторые руководящие принципы для значений FRET ³³ , ожидаемых для меченых нуклеиновых кислот ^{34, 35} . Общие стратегии конъюгации нуклеиновых кислот и белков кратко изложены в. Нуклеиновые кислоты лучше всего метить во время синтеза или с помощью оснований, модифицированных амином, которые можно отделить от немеченых молекул электрофорезом в полиакриламидном геле. Для взаимодействий нуклеиновая кислота-белок выгодно маркировать нуклеиновые кислоты из-за простоты конъюгации, обращения, очистки и гибкости в нанесении красителя.В исследованиях, связанных с взаимодействием белков с основной цепью ДНК, красители должны быть внутренне конъюгированы с использованием линкерных групп для предотвращения разрушения основной цепи. Экономично распространять модификации на две или более цепочек ДНК (или РНК) и отжигать их для создания конечной конструкции. В качестве общего подхода к сайт-специфической маркировке белков мы попытались пометить неприродную аминокислоту, содержащую кетонную группу ³⁶ , генетически кодируемую в геликазе Rep E.coli , используя Cy3 или Cy5-гидризид.

Таблица 2

Стратегии конъюгации для красителей или биотина

Обнаружение одиночных молекул

Спектроскопия полного внутреннего отражения

В TIR-микроскопии ^{40, 41} создается исчезающее поле возбуждающего света, которое распространяется только на ~ 100-200 нм от поверхности, к которой привязан образец, что значительно уменьшает фоновая флуоресценция (). Твердотельный лазер на 532 нм (~ 50 мВт) подходит для пар FRET, обсуждаемых здесь, и гелий-неоновый лазер на 633 нм (~ 30 мВт) или диодные лазеры с аналогичными длинами волн могут быть добавлены для проверки наличия акцептора.Интенсивность лазера ослабляется с помощью полуволновой пластины и поляризационного светоделительного куба (или с помощью фильтров нейтральной плотности). Путем возбуждения большой площади (∼0,05 мм размером ² ) и использования детектирования на основе камеры параллельно отображаются сотни молекул. Обычно используется лазерный стол с плавающими в воздухе ножками, но макетная плата толщиной ∼25 мм с равномерно расположенными резьбовыми отверстиями, установленная на обычном лабораторном столе или столе, достаточно устойчива для TIR smFRET. Существует два типа TIR: призменный (PTIR) и объективный (OTIR) ().

Схема для спектроскопии smFRET. Этикетки — М, зеркальные; DM — дихроичное зеркало; L, линза; CCD, камера устройства с зарядовой связью; BE, расширитель луча; PBS, поляризационный светоделитель; λ / 2, полуволновая пластина ( a ), возбуждение TIR и обнаружение излучения одной пары FRET. Привязанные одиночные молекулы возбуждаются либо PTIR, либо OTIR. Флуоресценция собирается с помощью объектива, а щель создает конечную область изображения, которая составляет половину области изображения CCD. Коллимированное изображение разделяется на излучение донора и акцептора и отображается бок о бок на ПЗС-камере (см. Изображение камеры на вставке).( b ) Схемы возбуждения МДП (увеличенный вид коробки на (а)). В режиме PTIR лазерный луч, сфокусированный под большим углом падения ( θ _c > 68 °) на призму, расположенную в верхней части образца, создает исчезающее поле (EF) на границе раздела кварц / вода на предметном стекле. Поочередно при возбуждении OTIR сфокусированный лазерный луч падает на периферию задней фокальной плоскости объектива, вызывая TIR на границе раздела стекло / вода на покровном стекле рядом с объективом. ( c ) Обнаружение излучения для трех цветовой схемы.Изображение кадрируется с помощью щели, так что конечный размер изображения покрывает одну треть кристалла ПЗС. Набор дихроиков позволяет разделить отдельные излучения трех флуорофоров и визуализировать их одновременно.

В PTIR инвертированный микроскоп приспособлен для удерживания призмы из плавленого кварца наверху канала для образца, а флуоресценция собирается с объектива под ^{40, 41} (). После того, как падающий лазерный луч фокусируется с помощью линзы с длинным фокусным расстоянием, он входит в призму, проходит через масло для согласования показателя преломления и внутренне отражается на границе раздела кварц-вода (и дополнительные методы онлайн).Сигнал флуоресценции собирают с помощью иммерсионного объектива с большим рабочим расстоянием (60 ×, числовая апертура 1,2 (NA)). PTIR необходим для экспериментов по закачке жидкости, потому что его отображающая поверхность, состоящая из предметного стекла толщиной 1 мм, не изгибается при изменении давления во время потока. Дорогие (но пригодные для вторичной переработки) кварцевые предметные стекла необходимы для минимизации фона флуоресценции, и призму необходимо собирать заново каждый раз, когда загружается новый образец. Необходимость перенастройки пути освещения сводится к минимуму, если призма воспроизводимо размещается в одном и том же месте относительно корпуса микроскопа.

OTIR полагается на использование нефтяной цели с высоким NA для создания быстро исчезающего месторождения. Фокусировка луча в задней фокальной плоскости генерирует параллельный луч, выходящий из объектива, а затем, переводя его на периферию объектива, создает ПВО на границе раздела стекло / вода ^{40, 41} (). Флуоресценция молекул, привязанных к поверхности покровного стекла, собирается с использованием того же объектива. OTIR имеет более высокую эффективность сбора фотонов, освобождает пространство над образцом для дополнительного контроля образца и имеет коммерческие возможности.Во многом благодаря использованию объектива с низкой флуоресценцией UPlanSApo (100 ×, 1,4 NA, Olympus) мы можем получить данные smFRET для пары Cy3 / Cy5 с отношением сигнал / шум и площадью изображения, сравнимыми с призматическим типом ( неопубликованные результаты).

Обнаружение излучения

TIR-микроскопия приобрела популярность, отчасти благодаря новой волне высокочувствительных и быстрых фотоаппаратов с электронно-умножением на заряженные пары (EM-CCD) ^{3, 42} . В установках smFRET обычно используются EM-CCD, которые обладают высокой квантовой эффективностью (85-95%) в диапазоне 450-700 нм, низким эффективным шумом считывания (<1 электрон, среднеквадратичное значение) даже при самой высокой скорости считывания (≥ 10 МГц), быстродействием скорость вертикального сдвига (≤ 1 мкс / строка; для достижения более высокой частоты кадров) и низкий уровень шума умножения.Используя EM-CCD 512 × 512 пикселей, мы можем получать данные с частотой от 33 Гц (при полном кадре) до 125 Гц (с биннингом 2 × 2).

Рассеянный свет возбуждающего лазера отклоняется от флуоресценции, собираемой объективом, с использованием длиннопроходного фильтра. Вертикальная щель вводится в плоскости формирования изображения сразу за боковым портом микроскопа, чтобы ограничить область изображения таким образом, чтобы окончательное изображение, падающее на ПЗС-матрицу, было вдвое меньше размера ПЗС-кристалла (). Затем флуоресцентное излучение донора и акцептора разделяется с помощью дихроичного зеркала.Регулируя смещение с помощью дихроичного и дополнительного зеркала, излучение донора и акцептора может отображаться на ПЗС-камере рядом друг с другом (вставка). Эта оптическая схема отображает область изображения ∼75 мкм × 37 мкм на ПЗС-чипе. Прямое расширение с использованием более узкой щели, соответствующей трети области ПЗС-матрицы, обеспечивает трехцветное обнаружение FRET (). Без дополнительных полосовых фильтров между каналами обнаружения возникают значительные перекрестные помехи (например, 40% излучения Cy5 попадает в Cy5.5, если Cy5.5 используется в качестве второго приемника), но тщательная калибровка и коррекция могут восстановить исходную интенсивность ⁴³ . Наш недавний тест показывает, что Cy7 является многообещающим флуорофором, который может заменить Cy5.5 в исходной трехцветной схеме FRET с одной молекулой; фотостабильность и яркость Cy7 были сопоставимы с таковыми Cy5.5, в то время как излучение Cy7 можно лучше отличить от излучения Cy5. Относительно низкая эффективность обнаружения камеры EMCCD на длине волны излучения Cy7 в настоящее время является проблемой, но это не должно быть проблемой для конфокальных измерений, поскольку кремниевый лавинный фотодиод поддерживает высокий квантовый выход обнаружения на этих длинах волн.Уменьшение пропускания в этой спектральной области можно до некоторой степени уменьшить с помощью оптимизированных для инфракрасного излучения объективов и оптики.

Подготовка образца к сбору данных

Иммобилизация поверхности

Хотя кварцевые слайды абсолютно необходимы для PTIR, тонкое покровное стекло формирует поверхность для визуализации OTIR, а обычные стеклянные покровные стекла обычно подходят для флуоресцентной визуализации одиночных молекул в OTIR. Для стабильной и специфической, но не мешающей иммобилизации образца на предметном стекле или покровном стекле обычно используется связь биотин-стрепавидин ^{5, 22, 44} .В эффективном методе исследований с участием только нуклеиновых кислот используется биотинилированный бычий сывороточный альбумин (биотин БСА), который адсорбируется на поверхности стекла / кварца и связывает биотинилированные молекулы через поливалентный стрептавидиновый белок (нейтравидин — менее дорогая альтернатива) (). При изучении белков неспецифическое связывание с поверхностью необходимо подавлять с помощью дополнительного пассивирующего агента, наиболее популярным из которых является полиэтиленгликоль (ПЭГ) ⁴⁵ . Предварительно очищенное поверхностно-активированное предметное стекло аминосиланизируется и реагирует с ПЭГ, модифицированным сложным эфиром N-гидроксисукцинимида (NHS), который также включает небольшую фракцию сложного эфира биотин-ПЭГ-NHS для специфического связывания () ⁴⁴ (Дополнительный протокол онлайн).Адгезию нуклеиновых кислот к поверхности ПЭГ при pH <7,0 можно уменьшить путем дальнейшей пассивирования поверхности сульфодисукцинимидилтартратом ⁴⁶ . Сильное взаимодействие между денатурированным белком и линейным ПЭГ можно устранить, используя вместо этого разветвленный ПЭГ, и они могут служить лучшими пассивирующими агентами ^{47, 48} . Белки, меченные гистидином, также могут быть прикреплены к поверхности с использованием хелатных групп Ni ²⁺ или Cu ^{2+ 49} , однако для оптимального ориентационного позиционирования и устранения поверхностных артефактов иногда может потребоваться спейсер между последовательностью гистидиновой метки и белок ().Некоторые из этих ПЭГилированных вариантов также коммерчески доступны (http://www.proteinslides.com/index.html). Более строгое отклонение неспецифического связывания может быть достигнуто путем повторения реакции ПЭГилирования два или три раза (Yuji Ishitsuka, личное сообщение).

Стратегии иммобилизации поверхности для экспериментов smFRET. ( a ) Белки биотин-БСА неспецифично связываются с биотинилированными молекулами поверхностного связывания с помощью поливалентных белков авидина (например, нейтравидина).(b ) Смесь биотин-ПЭГ и ПЭГ ковалентно прикрепляется к аминосиланизированной поверхности предметного стекла. Биотины на ПЭГ могут связываться с ДНК (или белком), сконструированной с биотиновой составляющей, с помощью сэндвича с белком нейтравидина. Покрытие PEG предотвращает неспецифическое связывание. ( c ) Поверхности, покрытые ПЭГ, могут быть сконструированы так, чтобы нести Ni ²⁺ или Cu ²⁺ , хелатированные на иминодиуксусной кислоте (IDA) (или нитрилотриуксусной кислоте (NTA)), которые эффективно связываются с 6x His-меченными белками. при сохранении функциональной активности.( d ) Используя димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) при комнатной температуре, везикулы, избирательно проницаемые для малых молекул, можно использовать для улавливания биомолекул. Фракция биотинилированного липида позволяет специфически прикреплять везикулы к поверхности биотин-ПЭГ. Этикетки D и A обозначают донорные и акцепторные красители.

Инкапсуляция одиночных молекул внутри фосфолипидных везикул, связанных с поверхностью ^50-52 имитирует клеточный захват, снижает возмущение в системе и не требует привязки к молекуле.С принятием полупроницаемых пузырьков ⁵³ , этот подход позволяет изучать повторяющиеся столкновения между одним и тем же набором слабо взаимодействующих молекул в различных условиях раствора, не страдая от высокого фона ().

Камера для образцов

Герметичная камера для образцов создается путем прослоения двухсторонней ленты или парафильма между предварительно очищенным предметным стеклом и покровным стеклом (см. Дополнительный протокол в Интернете) и путем нанесения эпоксидной смолы по мере необходимости. Простое пипетирование или перекачивание через два отверстия, предварительно просверленных в предметном стекле, позволяет заменять раствор без сушки ().Собранную камеру проверяют на неспецифическое связывание перед нанесением стрептавидина путем визуализации поверхности в присутствии 1 нМ меченой ДНК и / или белка. Если плотность неспецифически связанных флуоресцентных пятен составляет <10% от специфически связанных молекул (обычно специфическое прикрепление с «хорошей» плотностью обеспечивает ~ 0,1-0,2 пятен / мкм ² ), препарат на слайде считается приемлемым. После стрептавидина добавляют биотиновые биомолекулы в низких концентрациях (20-100 пМ в буфере, содержащем 0.1 мг / мл БСА для уменьшения потерь молекул на другие поверхности) для достижения иммобилизации при желаемой плотности одиночных молекул. Более высокая плотность увеличивает вероятность перекрытия соседних молекул. Фильмы с такими связанными молекулами приобретаются и сохраняются на жестком диске напрямую с помощью специальной программы, написанной на Visual C ++.

Камера для проб. ( a ) Камера для образца состоит из предметного стекла микроскопа и покровного стекла с двусторонним скотчем и герметизации эпоксидной смолой. Отверстия на слайде используются для входа и выхода обмена раствора.( b ) Шприц подсоединен к камере через трубку, а наконечник пипетки, содержащий раствор, плотно вставлен во входное отверстие. Когда шприц вытягивается, раствор вводится в камеру. Воспроизведено с ^{исх. 7} с разрешения Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Калибровка

Перекрестные помехи между каналами обнаружения необходимо скорректировать до оценки истинной эффективности FRET. С молекулами только донора и только акцептора, возбужденными на длинах волн возбуждения донора, мы определяем утечку излучения донора в канал (ы) акцептора и прямое возбуждение акцептора (ов) соответственно.При прямом возбуждении только акцепторных молекул (вблизи максимума поглощения) мы определяем утечку излучения акцептора в канал обнаружения донора.

Картирование между изображениями донора и акцептора выполняется с изображением привязанных к поверхности флуоресцентных микросфер со значительной эмиссией во всех каналах обнаружения. Мы вручную выбираем 3-4 пика флуоресценции в изображении донора и соответствующие им пики в изображении акцептора, и автоматический алгоритм генерирует линейное преобразование между двумя изображениями, которое корректирует смещение, поворот, масштабирование и искажение.

Обработка и анализ данных

Алгоритмы обработки данных

Чтобы преобразовать файлы фильмов во временные траектории одиночных молекул, мы сначала идентифицируем изолированные пики одиночных молекул из составного изображения донорных и акцепторных каналов (среднее значение первых десяти кадров), построенного с использованием сгенерированное отображение ( см. выше ). Совместно локализованные донорные и акцепторные пятна отбираются для окончательного анализа с целью удаления частично меченых молекул. Затем локальный фон вычитается из пиков, и интенсивности из 7 × 7 пикселей (в зависимости от общего увеличения), окружающие пик (что соответствует площади ∼ 1 мкм ² ), интегрируются, чтобы восстановить интенсивности доноров и акцепторов для каждой отдельной молекулы для каждый кадр.В экспериментах, где ожидается только временное присутствие меченой донором молекулы ⁵⁴ , первый шаг может быть выполнен для каждого набора из десяти последовательных кадров.

Эффективность FRET

После корректировки перекрестных помех и фона (определяемых по кривым интенсивности после фотообесцвечивания красителя) в обоих каналах, кажущаяся эффективность FRET рассчитывается как E _app = I _A / ( I _A + I _D ), где I _A и I _D представляют интенсивности акцептора и донора соответственно.Приложение E предоставляет только приблизительный индикатор расстояния между красителями из-за неопределенности в коэффициенте ориентации κ ² между двумя флуорофорами и необходимыми инструментальными поправками. Как показывает опыт, если анизотропия флуоресценции r обоих флуорофоров меньше 0,2, κ ² близка к 2/3 ^{34, 55} . Мы обнаружили, что в целом r > 0,2 для популярных флуорофоров smFRET, конъюгированных с нуклеиновыми кислотами или белками, поэтому необходимо соблюдать осторожность при извлечении информации об абсолютном расстоянии.Тем не менее, в каждом случае, который мы тестировали, кажущееся FRET было монотонной функцией расстояния. Чтобы определить фактическую эффективность FRET, необходимо определить поправочный коэффициент, γ , который учитывает различия в квантовом выходе и эффективности обнаружения между донором и акцептором. γ рассчитывается как отношение изменения интенсивности акцептора, ΔI _A к изменению интенсивности донора, ΔI _D при фотообесцвечивании акцептора ( γ = ΔI _A IΔI _Д ) ^{21, 56} .Затем рассчитывается скорректированная эффективность FRET с использованием выражения

Белки могут изменять фотофизические свойства флуорофора. Например, мы и другие наблюдали, что флуоресценция ДНК-конъюгированного Cy3 увеличивается, когда белок связывается около ^{57, 58} . Этот эффект изменяет эффективность FRET за счет изменения γ . Точно так же фотоиндуцированный перенос электронов между основаниями ДНК и красителем может тушить красители, и на это явление может влиять связывание с белками в окрестности ^59-61 .

Интерпретация данных: подводные камни и советы

Высокопроизводительные эксперименты на основе TIR помогают нам быстро получать статистически значимые объемы данных. Тогда основной проблемой является анализ и интерпретация данных, которые иногда могут сбивать с толку из-за потенциальных артефактов или двусмысленностей. Вот несколько советов о том, чего следует остерегаться.

1. Не останавливайтесь на «интересных» эффектах, наблюдаемых в небольшой части (<5%) молекул, потому что на этом уровне многие артефакты невозможно отличить от реальных событий.Вместо этого улучшите биологические конструкции и условия анализа, чтобы большинство молекул функционировало аналогичным образом.

2. Если поправочный коэффициент γ близок к 1, общий сигнал флуоресценции (сумма интенсивностей доноров и акцепторов), I total, должен оставаться постоянным. Постоянные изменения I _итого могут быть признаком неспецифической привязанности. Дополнительные источники интенсивного шума включают временное связывание флуоресцентных примесей, изменения свойств красителя из-за взаимодействия с белками или поверхностью или постепенную потерю фокуса.

3. Длинные видеоролики, которые показывают одноэтапные события фотообесцвечивания, должны быть сняты, чтобы убедиться, что полученный сигнал действительно исходит от отдельных молекул.

4. Обратимое выключение (так называемое мигание) Cy5 (или подобных красителей) ⁶² — хорошо известный артефакт (см.), Который часто ошибочно интерпретируется как большое изменение конформации в состояние с очень низким FRET, например макромолекулярное разворачивание. Эмпирическое правило состоит в том, что если FRET мгновенно падает до уровня только донора ( E _app = 0), считайте, что это мигает.Если очень низкое состояние FRET обнаруживается даже в присутствии подавителей мигания, таких как Trolox, и если прямое возбуждение акцептора подтверждает его активность, можно исключить мигание. Фотофизические явления, такие как мигание, также можно отличить по их известной зависимости от интенсивности возбуждения ²⁸ .

Хотя анализ данных по отдельным молекулам зависит от системы, стоит упомянуть некоторые часто используемые инструменты. Информацию о свойствах равновесия лучше всего получить с помощью гистограммы smFRET, полученной путем усреднения эффективности FRET каждой молекулы по первым 3-10 точкам данных.Обычно мы получаем 10-20 коротких (~ 5 с) фильмов о различных областях выборки для объективного обзора распределения населения. Временные траектории отдельных молекул (из длинных фильмов) в равновесии передают ценную кинетическую информацию системы через время пребывания в каждом конформационном состоянии. Например, для системы с двумя состояниями, претерпевающих стохастические переходы, скорости переходов определяются из экспоненциального спада, подходящего к распределению времени пребывания каждого состояния ⁶³ , или путем выполнения автокорреляционного анализа в сочетании с определением равновесия, если переходы слишком быстры для надежных определение времени ожидания ⁶⁴ .Для более сложных переходов между отчетливо идентифицируемыми множественными состояниями можно использовать анализ скрытой марковской модели (HMM) для несмещенной оценки количества заселенных состояний FRET, оценки скорости взаимного преобразования между ними и определения наиболее вероятной временной эволюции каждое состояние ⁶⁵ (доступно для загрузки на http://bio.physics.uiuc.edu/HaMMy.html). График плотности переходов от начальных к конечным значениям FRET для каждого перехода, полученный из анализа HMM (или другого), обеспечивает визуально привлекательную и объективную компиляцию данных ^{57, 65-67} .Другие подходы, основанные на теории информации, также доступны для данных о конфокальных одиночных молекулах, полученных фотон за фотоном ^68-70 . Преимущества экспериментов с одной молекулой становятся более очевидными в неравновесных условиях, когда можно проследить, например, путь реакции одного фермента, претерпевающего серию переходов для достижения своего каталитического цикла. Мощный визуальный метод представления неравновесных данных smFRET многих молекул был разработан для исследований рибосом ⁷¹ .

Ограничения smFRET

Крайне важно указать на некоторые ограничения метода до того, как кто-то спроектирует первый эксперимент smFRET. (1) smFRET требует присоединения по крайней мере двух внешних красителей к интересующей молекуле (ам), поскольку (полу) собственные хромофоры, такие как 2-аминопурин и триптофан, недостаточно яркие или фотостабильные для измерения одиночных молекул. В некоторых случаях сайт-специфическое мечение не является тривиальным, особенно для больших молекул РНК ^{72, 73} и многих белков ^{74, 75} .Обратите внимание, что smFRET относительно нечувствителен к неполной разметке. Если донор отсутствует, молекула просто не наблюдается; если акцептор отсутствует, этот вид только-донора обнаруживается как популяция с нулевым FRET. (2) Поскольку обнаружение одиночных молекул достигается за счет пространственного разделения, слабо взаимодействующие флуоресцентные частицы трудно изучать (но не всегда, см. Выше ). (3) FRET нечувствителен к изменениям расстояния за пределами диапазона расстояний между красителями 2-8 нм для R ₀ = 5 нм.Однако изменение расстояния до 0,3 нм может быть обнаружено для одиночных молекул между 0,6 R ₀ и 1,5 R ₀ , где FRET является почти линейной функцией R. (4) Для достижения адекватного сигнала: Отношение к шуму, необходимо зарегистрировать ∼100 полных фотонов. Учитывая, что до фотообесцвечивания можно собрать более 10 ⁵ фотонов из отдельных молекул красителя, можно получить более 10 ³ точек данных. (5) Временное разрешение ограничено частотой кадров ПЗС-камеры (в лучшем случае = 1 мс).(6) Оценка абсолютного расстояния является сложной задачей из-за зависимости флуоресцентных свойств и передачи энергии от окружающей среды и ориентации красителей. Таким образом, smFRET использовался в основном для задач, где точная информация о расстоянии не важна. Тем не менее, можно сделать разумные оценки факторов ориентации ⁷⁶ , и контрольные эксперименты с каждым красителем могут обеспечить хорошее приближение расстояний между красителями ^{77, 78} . Опасения по поводу этих проблем можно было бы дополнительно уменьшить, используя избыточное количество ограничений расстояния в исследованиях триангуляции ^{79, 80} .

Усовершенствованные методы smFRET

Некоторые из новых и интересных технических разработок, все еще находящихся на стадии проверки принципа работы, кратко изложены ниже.

По мере усложнения исследуемой системы требуется дополнительная информация для устранения неоднозначности. Для этой цели был реализован трехцветный smFRET с использованием Cy3 (донор), Cy5 (акцептор 1) и Cy5.5 (акцептор 2) в качестве трех отдельных флуорофоров, оптимизации конфокальной оптики обнаружения и разработки новой схемы анализа данных ⁴³ .Используя эту технику, были обнаружены коррелированные движения различных сегментов четырехстороннего соединения ДНК (Холлидея). Трехцветный smFRET также работает на основе TIRF и привел к прямому наблюдению за движением белка на одноцепочечной ДНК (неопубликованные результаты). Трехцветное обнаружение одной молекулы также использовалось для различения нескольких видов и наблюдения взаимодействий между тремя разными молекулами ^{81, 82} . Многоцветная схема возбуждения для дальнейшего различения различных молекулярных частиц ^{83, 84} недавно была расширена до трехцветной FRET ⁸⁵ .Также были показаны перспективы дальнейшего расширения FRET с помощью нескольких флуорофоров на отдельных молекулах ДНК ⁸⁶ .

По мере признания важности механических факторов в биологии, к smFRET добавляется недостающее измерение контролируемого манипулирования силой с конечной целью измерения конформационных изменений с помощью флуоресценции как функции силы, применяемой такими методами, как оптические и магнитные. пинцет. Оптические пинцеты были объединены с функцией расшифровки флуоресценции одной молекулы ⁸⁷ и FRET ⁸⁸ , чтобы сообщить о принудительном распаковке шпильки ДНК.Магнитный пинцет использовали для построения калибровочной кривой FRET в зависимости от силы для энтропийной пружины, изготовленной из однонитевой ДНК ⁸⁹ . Совсем недавно отклик одиночных узлов Холлидея при низкой силе отслеживался с помощью гибридного инструмента, объединяющего FRET и оптический пинцет, чтобы составить карту 2D складывающегося ландшафта ⁹⁰ . smFRET также был объединен с одноканальной записью простого димерного канала грамицидина ^{91, 92} .

Заключительные примечания

Мы обсудили практические вопросы по хорошо зарекомендовавшей себя системе smFRET на основе МДП, а также кратко упомянули более футуристические технические разработки.Двумя областями, которые все еще не разработаны, являются измерения в живой клетке, что, вероятно, требует существенных улучшений зондов, и анализ динамики мембранных белков, что уже является сложной задачей на уровне ансамбля. Тем не менее, smFRET является одним из мощных инструментов для «изучения» динамики и взаимодействия отдельных биомолекул в реальном времени. Все, что нам нужно сейчас, — это открыть глаза «одной молекулы» на широкий спектр биомолекулярных взаимодействий, требующих тщательного изучения.

Дополнительный материал

Дополнительные материалы

Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассирования поверхности полиэтиленгликоля (ПЭГ)

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

Благодарности

Мы благодарим И. Расника, С. Маккинни, К.Джу, Р. Клегг, С. Мён и члены группы Ха в Университете Иллинойса и К. Дрексхаге из Университета Зигена за экспертные консультации и обсуждения, С. Сайед из Университета Иллинойса за закупку красителей и реагентов и П. Корниш, М. Бреннеру и Л. Суприя за внимательное чтение рукописи. К. Джу подготовил видеоинструкцию по приготовлению слайдов с ПЭГ. Авторская работа по FRET с одной молекулой финансировалась Национальным институтом здравоохранения, премией Национального научного фонда и Медицинским институтом Говарда Хьюза.SH также была поддержана Фондом научно-исследовательских работ для нового факультета Сеульского национального университета (Корея), грантом Министерства науки и технологий (№ RH0-2005-000-01003-0, 2007) и грантом на фундаментальные научные исследования из Кореи. Исследовательский фонд.

Список литературы

Оценка степени молекулярного контакта между поверхностями целлюлозных волокон с помощью микроскопии FRET

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET)

Следующее краткое введение в теорию Фёрстера было взято из книги Б.W. Van der Meer (Meer 2013) и частично основан на оригинальных статьях Фёрстера. Эффективность передачи энергии между донорным и акцепторным красителем зависит от расстояния между двумя молекулами и, в принципе, определяется радиусом Ферстера (\ (\ text {R} _0 \)). Радиус Ферстера можно рассчитать для любой комбинации донорных и акцепторных молекул, как показано в дополнительной информации (Таблица S1). \ (\ text {R} _0 \) специфичен для каждой пары донор-акцептор в конкретной системе.6} \ end {align} $$

(1)

где r обозначает расстояние между донором и акцептором, а \ (\ text {R} _0 \) обозначает радиус Ферстера пары донор-акцептор. На практике эффективность FRET может быть измерена различными методами, которые могут быть реализованы либо в установках микроскопии, либо измерены с помощью спектрофотометрии, оба из которых были использованы в этой статье.

Независимо от метода измерения, процесс FRET может быть обнаружен по различным аспектам эффекта.FRET изменяет интенсивность излучения донора (гашение донора), интенсивность излучения акцептора (чувствительность акцептора), время жизни флуоресценции донора (измерения времени жизни) и поляризацию света (измерения анизотропии). Здесь мы использовали два из наиболее распространенных метода измерения FRET, а именно тушение донора (DQ) и акцепторную чувствительность (AS). Тушение донора измеряет уменьшение флуоресценции донора из-за FRET. Чувствительность акцептора измеряет увеличение флуоресценции акцептора из-за FRET.Хотя DQ является показателем для FRET, нельзя быть уверенным в этом, поскольку существуют другие механизмы, такие как гашение концентрации, которые могут дезактивировать возбужденный донор. AS, с другой стороны, предоставляет убедительные доказательства для FRET, поскольку флуоресценция акцептора может быть увеличена только за счет некоторого рода передачи энергии (Meer 2013). Отличный обзор реализации и подводных камней метода предоставлен Broussard et al. (2013). Здесь следует упомянуть одну важную часть использования FRET — это тщательно проверять, действительно ли сигнал действителен, особенно когда спектроскопические данные недоступны.Это можно сделать, используя отрицательные контроли, динамический FRET или применяя более одного метода FRET.

Материалы

Красители 7- (диэтиламино) кумарин-3-карбогидразид (DCCH, Purity \ (95 {\%} \), CAS: 100343-98-4) и флуоресцеин-5-тиосемикарбазид (FTSC, Purity \ (99 {\%} \), CAS: 76863-28-0) были куплены у Santacruz Biotechnology. Растворители N, N-диметилформамид (DMF), тетрагидрофуран (THF) и ацетонитрил были приобретены в VWR. Все химические вещества использовались без дополнительной очистки.Поли (2-гидроксиэтилметакрилат) (pHEMA) для производства тонких пленок был приобретен у Sigma Aldrich. Модельные пленки наносились на фольгу из ПЭТФ. Используемая целлюлоза представляла собой небеленую крафт-целлюлозу из мягкой древесины промышленного производства.

Подготовка образца

Для исследования волокон целлюлозы [беленая крафт-древесина, соотношение ель / сосна (90/10)] образцы готовили, как описано Thomson et al. (2007). Волокна окрашивали в 15 мл раствора любого из красителей в ДМФА (1 ммоль / л и 0.2 ммоль / л) в течение ночи при pH 5, регулируемом добавлением HCl. Красители образуют метастабильную связь с восстанавливающим концом молекулы целлюлозы, и при добавлении HCl это равновесие смещается в сторону метастабильных видов связи. После окрашивания к раствору немедленно добавляли боргидрат натрия \ (\ hbox {NaBH} _4 \) (0,02 ммоль \ (\ text {NaBH} _4 \) на 0,5 г волокон) и давали ему прореагировать в течение 1 часа. Боргидрат натрия приводит к восстановительному аминированию красителей с целлюлозой, что приводит к ковалентной связи между реагентами.После этого восстановительного аминирования образцы сначала промывали в ДМФ и снова промывали экстракцией Сокслета ацетонитрилом в течение не менее 4 часов для удаления любого нековалентно связанного красителя. Впоследствии окрашенные волокна хранили в водном буферном растворе с pH 9 с использованием буры 0,4 г / л. Волокнистые связки были приготовлены путем скрещивания одного окрашенного DCCH волокна и одного окрашенного FTSC волокна в капле воды (pH 9) и последующей их сушки в листообразователе Rapid Köthen. Затем для микроскопии связки волокон переносили на предметные стекла.Перекрестки волокон (отрицательный контроль для FRET) получали путем простого пересечения двух волокон и покрытия их покровным стеклом для микроскопии.

Модельные пленки были приготовлены методом докторблейдинга \ (500 \, {\ upmu} \ hbox {L} \) \ (10 ​​{\%} \) pHema в растворе 95/5 EtOH / h3O, смешанном с растворенными красителями. в THF на полиэтиленовую пленку. Это привело к ок. \ (1.5 \, {\ upmu} \ hbox {m} \) толстая пленка. Для обеспечения щелочных условий к раствору добавляли объем \ (12 \, {\ upmu} \ hbox {L} \) триэтиламина. Фольга ПЭТ была очищена ацетоном перед нанесением лака.\ circ \ hbox {C} \) для \ (3 \, \ hbox {h} \) для установления контакта. Концентрации и применяемые методы измерения для образцов можно увидеть в Таблице 1.

FRET из спектрофотометрии

Спектры флуоресценции были записаны на RF-5301PC, спектрофлуорофотометре от Shimadzu. Эксперименты FRET проводились с концентрациями молекул, указанными в таблице 1. Также были приняты меры для минимизации воздействия окружающего света на любой из образцов, чтобы избежать фотообесцвечивания.Модельные пленки, с одной стороны, были исследованы с использованием этой установки флуорометрии, а с другой стороны, они были исследованы с помощью широкоугольного микроскопа с наборами фильтров, показанными в таблице 2. Спектры пленок pHema были записаны с использованием установки, показанной на рис. 3. Образцы исследовали под углом, который позволяет избежать обнаружения прямо отраженного света и измеряет только флуоресценцию, исходящую от образца.

Установка для измерения пленок pHema во флуорометрии.В и настройка объясняется более подробно. Он был выбран таким образом, чтобы отраженный (REFL) луч, следующий за возбуждением (EX) образца, не попадал на детектор, и регистрировался только сигнал флуоресценции, испускаемый (EM) непосредственно от образца. a — c Образцы донора, акцептора и донора-акцептора в том виде, в каком они были исследованы

Эффективность передачи энергии FRET рассчитывается по измеренным спектрам и поясняется на рис.4. За счет передачи энергии излучение донора гасится (\ (\ text {I} _ {DA} \)) относительно нормального излучения донора (\ (\ text {I} _ {D} \) ). Энергия, не испускаемая донором, затем передается акцептору и увеличивает (или сенсибилизирует) излучение (\ (\ text {I} _ {AD} \)) по сравнению с нормальной чувствительностью акцептора (\ (\ text {I}) _ {A} \)). Спектральное перекрытие, показанное на рис. 4, является необходимым требованием для FRET и в значительной степени определяет диапазон расстояний эффекта, как можно увидеть в уравнении.{1/6} $$

(2)

\ (\ text {R} _0 \) — радиус Ферстера, k — фактор ориентации, n — показатель преломления, (\ (\ text {Q} _ {D} \)) — квантовый выход донора и J интеграл перекрытия. Радиус Ферстера определяет расстояние передачи энергии, поскольку известно, что количественная оценка FRET возможна только в пределах расстояний от \ ((\ frac {1} {2} — 2) \ text {R} _0 \), как также изображено на рис. 2. Подробное описание того, как определить радиус Ферстера, можно найти в FRET — Förster Resonance Energy Transfer Мединца и Хильдебрандта (Meer 2013).

Спектры возбуждения и излучения типичной донорно-акцепторной пары. FRET влияет на интенсивность излучения донора (тушение донора) и интенсивность излучения акцептора (чувствительность акцептора). Также показано спектральное перекрытие донорного излучения и спектра возбуждения акцептора.

Спектры флуоресцентного излучения DCCH и FTSC частично перекрываются, как показано на рис. 7. Следовательно, для получения точного измерения эффективности FRET спектры должны быть спектрально несмешанными.Для этого в спектрометре мы подгоняли пики излучения и использовали площадь под пиками как интенсивность подобранного сигнала. Практически это было сделано путем подгонки гауссовых пиков к зарегистрированным спектрам излучения чистого донорного образца (в результате получилось \ (\ text {I} _ {D} \)), чистого акцепторного образца (в результате \ (\ text {I}) _ {A} \)) и образец, представляющий интерес (в результате были \ (\ text {I} _ {DA} \) и \ (\ text {I} _ {AD} \)), как на рис. 11. Полные параметры подгонки можно найти в дополнительной информации (рисунок S3 и таблица S2).Полученная информация об интенсивности использовалась с уравнениями. 3 и 4, чтобы получить эффективность FRET. Для тушения доноров (уравнение 3) и акцепторной чувствительности (уравнение 4) использовались следующие уравнения.

$$ \ begin {выровнено} \ eta _ {FRET} = 1 — \ frac {I_ {DA}} {I_D} \ end {выровнено} $$

(3)

$$ \ begin {align} \ eta _ {FRET} = \ left (\ frac {I_ {AD}} {I_A} — 1 \ right) \ frac {\ epsilon _A} {\ epsilon _D} \ end { выровнено} $$

(4)

\ (\ epsilon _ {A} \) и \ (\ epsilon _ {D} \) — коэффициенты экстинкции акцептора и донора на длине волны возбуждения (Meer 2013; Clegg 1992, 1995).Отношение \ (\ frac {\ epsilon _ {A}} {\ epsilon _ {D}} \) было определено равным 0,02, и его можно найти в дополнительной информации (Таблица S1). Чувствительность акцептора и эмиссия донора схематически показаны на рис. 4.

FRET с оптической микроскопии

Бумажные волокна были исследованы с использованием установки для широкопольной микроскопии (WM), оснащенной наборами фильтров, показанными в таблице 2. WM работал с Галогенная лампа 50 Вт и КМОП-детектор от QI Imaging (Optimos).

Как интенсивность лампы, так и чувствительность детектора показывают зависимость от длины волны и были скорректированы путем расчета поправочных коэффициентов из спектра излучения лампы, сложенного с фильтрами возбуждения, и коэффициентом экстинкции. и чувствительность детектора, сложенная с фильтрами излучения и спектрами излучения.Эти поправочные коэффициенты были применены к записанным изображениям, чтобы получить истинное представление об измеренной интенсивности.

Схематическое изображение окрашенных волокон и пленок pHema можно увидеть на рис. 5. Изображения имеют ложный цвет, чтобы подчеркнуть различия в волокнах / пленках. Образцы исследовались при увеличении в \ (400 \ раз \) для волокон и \ (50 \ раз \) в случае пленок. Чтобы минимизировать фоновый шум, микроскоп использовался в коробке, окруженной черной тканью.

Ложные цветные изображения a a волоконной связи и b a pHema пересечения, измеренные с помощью широкоугольного флуоресцентного микроскопа. В b также показаны типичные области интереса для алгоритмов Xia. Области выбраны так, чтобы свести к минимуму рассеянный свет от другого волокна / пленки

При использовании микроскопа используют спектральный диапазон для пространственной информации и теряют преимущество применения этого простого метода подбора, описанного выше.Здесь Гордон и др. Разработали сложный алгоритм, который приводит к полностью скорректированной оценке эффективности FRET. (1998). В методе используются изображения, записанные с помощью трех различных наборов фильтров из Таблицы 2 трех разных образцов. Обычно это приводит к получению всего девяти изображений, но с расположением, показанным на рис.5, можно получить ту же информацию только из трех изображений вместо этого, поскольку на каждом изображении автоматически присутствует чистый донор, чистый акцептор и область FRET. включены.Подробное описание алгоритма см. В исходной статье (Gordon et al. 1998). Вкратце, этот метод вычисляет интенсивность FRET, скорректированную для всех возможных сценариев спектрального просвечивания, в соответствии со следующими уравнениями.

$$ \ begin {align} {\ overline {Afa}} = \ frac {Af — \ left (\ frac {Ad} {Fd} \ right) Ff} {1 — \ left (\ frac {Fa} { Aa} \ right) \ left (\ frac {Ad} {Fd} \ right)} \ end {align} $$

(5)

$$ \ begin {align} FRET1 = \ frac {\ left (Ff — \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) Df — {\ overline {Afa}} \ left [\ left (\ frac {Fa} {Aa} \ right) — \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ right] \ right)} {G \ left [ 1 — \ left (\ frac {Da} {Fa} \ right) \ left (\ frac {Fd} {Dd} \ right) \ right]} \ end {align} $$

(6)

$$ \ begin {align} {\ overline {Dfd}} = Df + FRET1 \ left [1 — G \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ right] — {\ overline {Afa} } \ left (\ frac {Da} {Aa} \ right) \ end {align} $$

(7)

$$ \ begin {align} FRETN = \ frac {FRET1} {{\ overline {Afa}} * {\ overline {Dfd}}} \ end {выравнивается} $$

(8)

Уравнения состоят из переменных, состоящих из двух букв.Первая буква обозначает использованный набор фильтров, как показано в таблице 2, вторая буква — исследуемый образец (d = только донор, a = только акцептор, f = область FRET). Например. Следовательно, Af означает область FRET (связанная область), исследованная с помощью набора акцепторных фильтров. Переменные представляют собой измеренные значения интенсивности света из вышеупомянутых изображений микроскопа, записанные как 16-битные значения серого. \ ({\ overline {Afa}} \) относится к сигналу акцептора, который был бы, если бы донор не присутствовал и, следовательно, не происходил FRET.Точно так же \ ({\ overline {Dfd}} \) относится к донорскому сигналу, который был бы, если бы не присутствовал акцептор и, следовательно, не было бы FRET. На изображениях были выбраны интересующие области, как показано на рис. 5b. Оценка производилась по пикселям. G — фактор, связывающий потерю донорного сигнала с увеличением сигнала акцептора (см. Дополнительную информацию в таблице S3). В этой работе мы использовали несколько иной алгоритм Xia et al. который отличается только нормализацией значения \ (\ text {N} _ {\ text {FRET}} \), но в остальном эквивалентен алгоритму Гордона (Xia and Liu 2001).

$$ \ begin {выровнено} N_ {FRET} = \ frac {FRET1} {\ sqrt {{\ overline {Afa}} * {\ overline {Dfd}}}} [-] \ end {выровнено} $$

(9)

Демонстрация анализа FRET пересечения волокон a, a и b a. В и можно увидеть две типичные проблемы с анализом. Сначала высокий сигнал FRET часто обнаруживался на краях как области склеивания, так и волокон. Во-вторых, сильный ложноположительный сигнал FRET можно увидеть в области, которая явно не может показать FRET.На микроскопическом изображении можно увидеть метод эрозии, использованный для анализа.

Для возможности воспроизведения области молекулярного контакта был разработан метод, позволяющий всегда выбирать соответствующую область. Метод состоял в том, чтобы вручную нарисовать ROI (интересующую область), захватив «оптически связанную» область на рис. 6. Затем мы применили эрозию изображения, чтобы избежать краев и, таким образом, получить размытую область интереса (рис. 6, нижние изображения), которая затем использовали для оценки интенсивности FRET. Избегать краев было необходимо, потому что области экстремальной интенсивности, по-видимому, дают ложноположительный сигнал FRET.Кроме того, ложные срабатывания также были обнаружены в областях, на которых невозможно отобразить FRET, таких как область, показанная на фиг. 6a, которая не находится в связанной области.

Другие эксперименты FRET

Здесь следует упомянуть, что другие эксперименты FRET также использовались. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM, Leica TCS SPE) с фотоумножителем от Hamamatsu был использован для исследования фотообесцвечивания акцептора и сенсибилизированного излучения акцептора в связях волокно-волокно. Идея заключалась в том, что благодаря превосходной настройке будет достигнуто лучшее соотношение сигнал / шум.

Платформа гибридных биосенсоров BRET-FRET для оптогенетики, химического скрининга и визуализации in vivo

Конструирование плазмиды

Комплементарная ДНК (кДНК), кодирующая mTurquoise, и кДНК, кодирующая mTurquoise-GL, были получены от Joachim Goedhart ⁴³ . кДНК для Turquoise2-GL, mTurquoise2 и Turquoise2 были получены сайт-специфическим мутагенезом с помощью ПЦР. Были введены следующие мутации: I146F (для Turquoise2-GL и mTurquoise2) ⁴³ и K206A (для Turquoise2-GL).Прототип ERK-биосенсора активности FRET, EKAREVnes, состоит из ECFP и YPet для донорных и акцепторных флуоресцентных белков соответственно ¹⁹ . В дальнейшем белки, происходящие из бирюзы, и ECFP вместе называются CFP. Точно так же белки, производные YFP, включая YPet и Venus, вместе называются YFP. Чтобы сконструировать биосенсор hyBRET для активности ERK, hyBRET-ERK, кДНК ECFP в EKAREVnes была заменена на PCR-амплифицированную кДНК, кодирующую слитый белок, состоящий из Turquoise2-GL dC10, Gly-Thr и RLuc8 S257G dN3, с использованием рестрикционного расщепления с последующим перевариванием. путем сборки ДНК с помощью набора для клонирования In-Fusion HD (Takara Bio, Otsu, Japan).Точно так же CFP в PicchuEV-x ^19,44,45 и RaichuEV-Ras ^19,46 были заменены тандемно связанными Turquoise2-GL dC10 и RLuc8 S257G dN3 для образования hyBRET-PicchuX и hyBRET-HRas, соответственно. В качестве контроля мы разработали EKAREV-4464, заменив ECFP Turquoise2-GL dC10 из EKAREVnes. Варианты CFP hyBRET-ERK были получены путем замены Turquoise2-GL dC10 в hyBRET-ERK на mTurquoise2 dC10, Turquoise2 dC10 или ECFP dC10 посредством реакции In-Fusion. HyBRET-ERK с парой mVenus-mTurquoise2 был создан путем замены mVenus dC10 на YPet путем лигирования рестрикционных фрагментов.Варианты hyBRET-ERK NanoLuc также были получены реакцией In-Fusion. О CeNL, гибридном белке Turquoise2 и NanoLuc, сообщалось ранее ²² . Для разработки биосенсоров hyBRET для других киназ Ser / Thr сенсорный домен и соответствующий лигандный домен в hyBRET-ERK были заменены на таковые из AKAR3EV, JNKAR1EV и Eevee-S6K путем лигирования рестрикционных фрагментов, генерируя hyBRET-PKA, JNK и S6K, соответственно. . кДНК, кодирующие биосенсоры или флуоресцентные белки, субклонировали в вектор pCAGGS ⁴⁷ или вектор pPBbsr, транспозонный вектор PiggyBac с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) ⁴⁸ .Лентивирусный вектор для hyBRET-ERK был сконструирован путем вставки кДНК-кодирующих компонентов hyBRET-ERK, за исключением YPet, в вектор pCSII-EF с IRES-bsr (геном устойчивости к бластицидину) и оптимизированным по кодонам YPet для E . coli для подавления рекомбинации между гуманизированным YFP и CFP ⁴⁹ . Затем остаток треонина субстрата ERK в pCSIIbsr-hyBRET-ERK заменяли на аланин для создания устойчивого к фосфорилированию мутанта hyBRET-ERK-TA путем рестрикционного переваривания и последующего лигирования отожженного дуплекса олиго-ДНК.Чтобы сконструировать векторы для стабильной экспрессии биолюминесцентных белков в клетках млекопитающих, кДНК для RLuc8 S257G dN3 была вставлена ​​в вектор CSII-EF с IRES-puro, а кДНК для голубого нано-фонаря и желтого нано-фонаря были амплифицированы с помощью ПЦР и субклонированы в Вектор pPBbsr путем лигирования рестрикционных фрагментов. pCX4puro-CRY2-cRaf и pCX4neo-CIBN-EGFPx были описаны ранее ⁵⁰ . Для создания pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf кДНК, кодирующая mCherry, была амплифицирована с помощью ПЦР и слита с CRY2 в pCX4puro-CRY2-cRaf с помощью реакции In-Fusion.Затем cRaf в pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf был заменен линкером и каталитическим доменом мышиного Sos1 (aa 548–1020) или интер-Sh3 доменом p85 человека (aa 428–621), образуя pCX4puro-mCherry-CRY2- Soscat и pCX4puro-mCherry-CRY2-iSh3 соответственно. pT2ADW-hyBRET-ERK был сконструирован следующим образом: инсулятор D4Z4 был вставлен перед промотором CAG pT2AL200R175-CAGGS-EGFP, несущего сайты рекомбинации Tol2 ⁵¹ . Затем последовательность WPRE pCSII-EF была вставлена ​​перед последовательностью поли А.Наконец, EGFP был заменен кДНК hyBRET-ERK.

Культура клеток и создание стабильных клеточных линий

Клетки HeLa были приобретены в Human Science Research Resources Bank (Sennanshi, Japan). Клетки HCT116 и клетки 4T1 были получены из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Клетки Lenti-X 293T были приобретены у Clontech (Маунтин-Вью, Калифорния). Клетки РС9 были любезным подарком от Масато Окада (Университет Осаки, Япония). Клетки HeLa и Lenti-X 293T поддерживали в среде DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония).Клетки HCT116 выращивали в среде McCoy 5A (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Клетки 4T1 и клетки PC9 культивировали в RPMI1640 (ThermoFisher Scientific). Описанная выше среда для выращивания была дополнена 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и пенициллин / стрептомицин (Nacalai Tesque, Киото, Япония). Все клетки инкубировали во влажной атмосфере с 5% CO2 на воздухе при 37 ° C. Для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих биосенсоры hyBRET с помощью системы транспозонов, клетки котрансфицировали вектором pPB и pCMV-mPBase ⁴⁸ , полученным из Wellcome Trust Sanger Institute.Через день после трансфекции трансфицированные клетки отбирали с помощью 20 мкг / мл бластицидина S (InVivoGen, Сан-Диего, Калифорния), а затем дополнительно культивировали в течение по меньшей мере 1 недели. Для получения лентивируса клетки HEK-293T были котрансфицированы вектором pCSII-EF, psPAX2, который был получен от Addgene (плазмида № 12260) и pCMV-VSV-G-RSV-Rev, любезным подарком от Dr. Миёси (RIKEN BioResource Center, Ибараки, Япония) липофекцией с использованием полиэтиленимина «Макс» с молекулярной массой 40 000 (Polyscience Inc., Уоррингтон, Пенсильвания).Среды, содержащие вирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и концентрировали с помощью PEG6000. Клетки-мишени инфицировали в присутствии 10 мкг / мл полибрена (Nacalai Tesque). Через два дня после заражения инфицированные клетки отбирали с помощью бластицидина S с концентрацией 20 мкг / мл. Основная масса клеток использовалась в последующих анализах.

Реагенты

Диацетилцелентеразин-h синтезировали, как описано ранее ¹⁴ . Целентеразин-h и PD-0325901 были получены от Wako (Осака, Япония).Гефитиниб и AZD6244 были приобретены в компании Symansis (Шанхай, Китай). Анизомицин, dbcAMP и фактор роста эпидермиса были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Реагент для трансфекции 293fectin был получен от ThermoFisher Scientific и использован для липофекции плазмиды в клетки HeLa. Система анализа люциферазы Nano-Glo была приобретена у Promega (Мэдисон, Висконсин), и субстрат для анализа, включенный в набор, использовали в качестве исходного раствора фуримазина. Люциферины, используемые в каждом люминесцентном анализе, перечислены в таблице S3.

Спектроскопия

Для измерения спектров флуоресценции клетки HeLa, экспрессирующие только CFP, только YFP, или биосенсор помещали на 35-миллиметровую стеклянную чашку. Клетки наблюдали с помощью инвертированного микроскопа (IX81; Olympus, Tokyo), снабженного линзой объектива (масляный объектив UPLAPO 100 × / 1,35NA; Olympus). CFP возбуждались фильтром возбуждения FF02-438 / 24 (Semrock) и дихроичным зеркалом FF458-Di02-25×36 (Semrock). YFP возбуждали возбуждающим фильтром S492 / 18X (Chroma) и стеклянным дихроичным зеркалом (Olympus).Спектры флуоресценции регистрировали с интервалом 2 нм с использованием фотонного многоканального анализатора PMA-12 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Для измерения люминесцентных спектров клетки HeLa, экспрессирующие биосенсор, обрабатывали трипсином и суспендировали в M199 (ThermoFisher Scientific), содержащем 3% FBS и 20 мМ HEPES. К суспензии клеток добавляли 20 мкМ целентеразин-h или 3 мкМ фуримазин для регистрации спектров люминесценции с помощью PMA-12. Полученные спектры флуоресценции и люминесценции были использованы для оценки эффективности передачи энергии биосенсорами.

Оценка эффективности передачи энергии

Для оценки эффективности передачи энергии спектры флуоресценции и биолюминесценции биосенсора hyBRET были подогнаны к теоретическим спектрам излучения, по существу, как сообщалось ранее ²⁰ . Для нелинейной регрессии использовались метод Лербенберга-Марквардта, реализованный в функции nlinfit в MATLAB (MathWorks, Натик, Массачусетс) и функции решателя в Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон). Теоретические спектры флуоресценции описываются следующим уравнением:

$$ {\ rm {F}} (\ lambda) = {\ varepsilon} _ {c} ({\ lambda} _ {ex}) \ {(1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + {E} _ {CY} \ times {\ varphi} _ {Y} \ раз {f} _ {Y} (\ lambda) \} + {\ varepsilon} _ {Y} ({\ lambda} _ {ex}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda), $$

(1)

где F ( λ ) — флуоресценция на длине волны λ, ε _c ( λ _пр. ) — коэффициент возбуждения CFP на длине волны возбуждения, E _CY — КПД FRET между CFP и YFP, ϕ _C — квантовая эффективность CFP, f _C ( λ ) — нормированное излучение CFP на длине волны λ, ϕ _Y — квантовая эффективность YFP, f _Y ( λ ) — нормализованное излучение YFP, а ε _Y ( λ _пр. ) — коэффициент экстинкции YFP на длине волны возбуждения.Модель ε _Y ( λ _пр. ) значение при 440 нм, которое представляет перекрестное возбуждение YFP ​​в режиме FRET, составляет 2,9% от максимального ε _Y ( λ _пр. ) значение при 513 нм.

Если предположить, что слияние RLuc8 на С-конце в кадре не изменило физических свойств биосенсоров, теоретические биолюминесцентные спектры описываются следующим уравнением:

$$ \ begin {array} {rcl} { \ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {RC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ { C} (\ lambda) + ({E} _ {RY} + {E} _ {RC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {RC} — {E} _ {RY}) \ times {\ varphi} _ {R} \ times {f} _ {R } (\ lambda), \ end {array} $$

(2)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E _RC — это эффективность BRET между RLuc8 и CFP, E _RY — эффективность BRET между RLuc8 и YFP, ϕ _R — квантовая эффективность RLuc8, а f _R ( λ ) — нормализованное излучение RLuc8.

E _CY был оценен путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к формуле. 1. E _RC считается постоянным независимо от конформации биосенсора, поскольку линкер между RLuc8 и CFP был оптимизирован для максимизации эффективности BRET и стабилизации структуры слитого белка RLuc8-CFP. Следовательно, E _RC Nano-lantern используется для биосенсора hyBRET.Квантовая эффективность голубого нано-фонаря, ϕ _CNL , выражается следующим уравнением:

$$ {\ varphi} _ {CNL} = {\ varphi} _ {C} \ times {E} _ {RC} + {\ varphi} _ {R} \ times (1- {E} _ {RC}), $$

(3)

Используя данные квантовой эффективности, приведенные в таблице S1, E _RC было определено как 0,13. Наконец, E _RY было оценено путем подгонки измеренных биолюминесцентных спектров к формуле.2. Значения ε и ϕ перечислены в таблице S1.

Скорость передачи энергии биосенсоров, содержащих NanoLuc, определяли аналогично биосенсорам, содержащим RLuc8, путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к уравнению. 4.

$$ \ begin {array} {rcl} {\ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {NC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + ({E} _ {NY} + {E} _ {NC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ {Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {NC} — {E} _ {NY}) \ times { \ varphi} _ {N} \ times {f} _ {N} (\ lambda), \ end {array} $$

(4)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E _NC — эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E _NY — это эффективность BRET между NanoLuc и YFP, ϕ _N — квантовая эффективность NanoLuc, а f _N ( λ ) — нормализованное излучение NanoLuc.Обратите внимание, что эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E _NC , был также оценен по формуле. 4, установка E _NY и E _CY как ноль.

Покадровая визуализация культивируемых клеток

Покадровая съемка была получена и обработана с использованием, по существу, тех же условий и процедур, что и ранее. ⁵² .Вкратце, клетки HeLa, экспрессирующие биосенсоры hyBRET, голодали в течение 3-8 часов с помощью FluoroBrite DMEM (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс) с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия (Thermo Fischer Scientific), GlutaMax и пенициллина. /стрептомицин. При необходимости голодные клетки обрабатывали стимулом в процессе покадровой визуализации. Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа (IX83; Olympus, Токио), оснащенного линзой объектива (масляный объектив UPlanSApo 60 × / 1,35NA; Olympus), системой освещения (световой двигатель Spectra-X; Lumencore, Бивертон, Орегон), Лазерная система автофокусировки IX3-ZDC2 (Olympus), автоматически программируемый XY-столик MD-XY30100T-Meta (SIGMA KOKI, Токио) и инкубатор INUG2F-IX3W (Tokai Hit, Фудзиномия, Япония).В каждом эксперименте использовалась одна из следующих камер: CCD с охлаждением MD-695 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), EMCCD с охлаждением iXon Ultra 888 (ANDOR, Белфаст, Великобритания) и EMCCD с охлаждением Rolera Thunder (QImaging, Surey, BC) . Для визуализации FRET клетки подвергали воздействию света 440 нм с интенсивностью света 25 мкВт / см ² в течение 30–200 мс, и получали изображения FRET и CFP. Для визуализации BRET в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-h или 3 мкМ фуримазин (Promega) перед началом визуализации.Голубое свечение и желтое свечение клеток регистрировали при времени экспозиции от 6 до 30 с, в зависимости от камеры, используемой в каждом эксперименте. Чтобы уменьшить рассеянный свет от микроскопа и окружающей среды во время визуализации BRET, в IX83 был включен режим аппаратного затемнения, верх нагревателя предметного столика был покрыт алюминиевой фольгой, и эксперименты проводились в темной комнате. Дихроичные зеркала и фильтры, использованные в этой работе, представляли собой дихроичное зеркало FF458-Di02-25×36 для CFP и FRET, три эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для CFP и голубой люминесценции, FF01-542 / 27-25 для FRET, YFP и желтое свечение и FF01-624 / 40-25 для mCherry) от Semrock (Рочестер, Нью-Йорк) и стеклянный отражатель U-MREF, используемый в качестве дихроичного зеркала для YFP и mCherry от Olympus.Для визуализации BRET не использовалось дихроичное зеркало.

Обработка изображений

Программное обеспечение Metamorph (Molecular Devices) и программное обеспечение Safir (Roper Scientific France, Lisses, Франция) использовались для уменьшения шума и анализа изображений. После вычитания фона изображения отношения FRET / CFP были созданы и представлены в режиме отображения с модуляцией интенсивности (IMD). В режиме IMD восемь цветов от красного до синего используются для представления отношения FRET / CFP, причем интенсивность каждого цвета указывает среднюю интенсивность каналов FRET и CFP.Для люминесцентных изображений вычитанию фона предшествовало удаление космических лучей и уменьшение шума ⁵³ . Затем были созданы изображения с соотношением желтого / голубого люминесценции таким же образом, как и изображения с соотношением FRET / CFP. Двухволновые изображения, полученные при люминесцентном изображении всего тела, были разделены между желтым и голубым люминесцентными изображениями после удаления шума и вычитания фона. На рис. S7 сигналы от голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были разделены линейным разделением.

Optogenetics

Клетки HeLa трансфицировали вектором экспрессии для биосенсора hyBRET, pCX4neo-CIBN-EGFP-x и вектором экспрессии для слитого белка CRY2.Через день после трансфекции клетки голодали с помощью FluoroBrite DMEM с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия и GlutaMAX в течение 3-8 часов. Перед началом визуализации в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-ч. Канал mCherry использовался для определения фокуса и положения стадии, чтобы не запускать транслокацию через мембрану слитых с CRY2 сигнальных молекул. Визуализацию BRET выполняли, как описано выше. В момент времени 0 клетки освещали светом 490 нм (55 мкВт / см ² ) в течение 100 мс.Чтобы оценить влияние освещения синим светом на соотношение BRET сенсоров hyBRET и интенсивность люминесценции RLuc8, клетки трансфицировали pCAGGS-hyBRET-ERK или pCSIIpuro-RLuc8. На следующий день клетки голодали и получали люминесцентное изображение, как описано выше. Во время визуализации клетки освещали светом 440 нм (200 или 450 мкВт / см ² ) или светом 490 нм (180 мкВт / см ² ) в течение 5 с в заранее определенные моменты времени. Плотность света измеряли измерителем оптической мощности TQ8230 (Advantest).

Анализ на микропланшетном ридере

Клетки, экспрессирующие hyBRET-ERK, высевали на 96-луночные белые планшеты при плотности клеток 3000 клеток / лунку. На следующий день клетки обрабатывали серийно разведенным AZD6244, ингибитором MEK, в течение 20 минут. Цифровой диспенсер HP D300 (Tecan, Männedorf, Швейцария) использовался для разбавления лекарственного средства и добавления в лунку. После обработки лекарственным средством в каждую лунку добавляли среду, содержащую 1 мкМ коелентеразин-h с серийно разведенным ингибитором, и измеряли желтое и голубое свечение с помощью устройства для считывания микропланшетов GloMax Discover (Promega).Фильтр короткого прохода 495 нм использовали для голубой люминесценции, а фильтр длиной 530 нм использовали для желтой люминесценции. В мультиплексном анализе, показанном на рис. 4c – f, среду заменяли 250 мкл FluoroBriteDMEM с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, GlutaMAX и пенициллина / стрептомицина после прикрепления клеток ко дну лунки. Через несколько часов после смены среды клетки обрабатывали серийно разведенным гефитинибом в течение 1 дня. Голубое свечение и желтое свечение клеток hyBRET-ERK, обработанных лекарственным средством, измеряли в присутствии 1 мкМ целентеразина-h.{\ prime} = 1- \ frac {3 (S {D} _ {AZD0} + S {D} _ {AZD1})} {Av {e} _ {AZD0} -Av {e} _ {AZD1}} $$

(5)

Здесь SD — это стандартное отклонение, а Ave — это среднее значение желтого / голубого люминесценции из 3 лунок, обработанных без AZD6244 (AZD0) или 1 мкМ AZD6244 (AZD1). На рис. 4f теоретические функции, описанные ниже, использовались в качестве модельных функций для соответствия экспериментальным данным, как сообщалось ранее ²⁶ . Уравнения представляют взаимосвязь между активностью ERK и количеством живых клеток.{\ frac {1} {n {H} _ {ERK}}} $$

(7)

Здесь min — минимум, amp — амплитуда, IC50 — это половина максимальной ингибирующей концентрации, а nH — коэффициент Хилла количества живых клеток (L) или активности ERK (ERK). ERK — это соотношение желтого / голубого люминесценции hyBRET-ERK. Поскольку минимумы и амплитуды были однозначно определены из экспериментальных данных, IC50s и nHs были подобраны как свободные параметры.

Образование опухоли ксенотрансплантатом и генерация трансгенных мышей

Самок мышей BALB / c nu / nu в возрасте 7–9 недель (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) использовали для образования опухоли ксенотрансплантата.1 × 10 ⁶ клеток HeLa, стабильно экспрессирующих желтый нано-фонарь и голубой нано-фонарь в 50 мкл GelTrex / PBS (1: 1) (ThermoFisher Scientific), вводили подкожно в левый и правый бок мышей. Мышей визуализировали через две недели после трансплантации. Для исследования метастазов опухоли мышам внутривенно вводили 1 × 10 ⁵ клеток опухоли молочной железы мыши 4T1, стабильно экспрессирующих hyBRET-ERK или hyBRET-ERK-TA в PBS в хвостовой вене, и анализировали через 2–3 недели после инъекции опухоли 4T1. .Трансгенные мыши были получены с помощью Tol2-опосредованного переноса гена ⁵⁴ . Вкратце, оплодотворенные яйца, полученные от мышей Jcl: B6C3F1 (B57BL / 6N Jcl X C3H / HeN Jcl), микроинъектировали смесью мРНК Tol2 и pT2ADW-hyBRET-ERK. Животных-основателей скрещивали с мышами Jcl: ICR для получения стабильных линий. Новорожденных мышей освещали синим фонариком LEDGFP-3W (Optocode, Tokyo) и проверяли на зеленую или красную флуоресценцию через желтые очки. Протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Высшей школы медицины Киотского университета (No.10584, 14079, 15064, 16038 и 17539), и методы были выполнены в соответствии с соответствующими директивами и правилами.

Биолюминесцентная визуализация всего тела животных

Для сравнения продолжительности жизни биолюминесценции между аналогами коэлентеразина-h in vivo (рис. S7) мышей с подкожными опухолями анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) в этаноле / PBS (1: 4) или диацетил-коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) / Pluronic F-127 (20% мас. / об. в DMSO) (Biotium, Hayward , CA) (1: 1) растворяли в PBS.Для получения люминесцентных изображений мышей с метастазированными опухолями (рис. 5a – j и S8) мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили смесь диацетил-целентеразина-h (200 мкг на мышь. ) и носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 в Pluronic F-127 (20% мас. / об. в ДМСО) / PBS (1: 1) (общий объем составлял 100 мкл / мышь). Для визуализации трансгенных мышей, экспрессирующих hyBRET-ERK (рис. 5k), трансгенных мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0.5 л / мин) и вводили 1 мМ диацетил целентеразин-h, растворенный в PBS, содержащем 1% Pluronic F-127 (20% мас. / Об. В ДМСО), путем непрерывной внутривенной инфузии со скоростью 90 мкл / час с помощью шприцевого насоса Model 11 plus (Harvard Аппарат, Холлистон, Массачусетс). Носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 (общий объем составлял 100 мкл / мышь) вводили внутрибрюшинно во время визуализации. Изображение мышей получали с помощью имидж-сканера MIIS (Molecular Devices), оснащенного камерой iXon Ultra 888 EMCCD (ANDOR), оптикой разделения изображений W-VIEW GEMINI (Hamamatsu Photonics), системой светодиодного освещения XT640-W (Lumen Dynamics, Missisauga, ON ) и монофокальный телецентрический объектив TEC-55 (Computar, Cary, NC), управляемый программой Metamorph (Molecular Devices).Во время люминесцентной визуализации мышей держали под анестезией изофлураном и держали в тепле с помощью пластины предварительного нагрева Chamlide (Live Cell Instrument, Сеул, Корея). Желтое свечение и голубое свечение опухолей регистрировали при следующих условиях: время воздействия 30 с (для подкожных опухолей) или 4 мин (для метастазированных опухолей), усиление ЭМ 1000 (максимум) и биннинг ПЗС 1. Дихроичное зеркало и Эмиссионные фильтры, установленные в W-VIEW GEMINI для двухцветного люминесцентного изображения in vivo , представляли собой дихроичное зеркало FF509-Di01-25×36 и два эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для голубой люминесценции и FF01-542 / 27- 25 для желтого свечения) и были получены от Semrock.

Прижизненная FRET-визуализация легкого мыши

Мышей с метастатической опухолью 4T1 анестезировали изофлураном (1% ингаляция, 0,5 л / мин). Часть кожи на левой груди была разрезана, чтобы обнажить поверхностный мышечный слой и ребра. Горло мышей разрезали по средней линии глотки, чтобы обнажить трахеальную трубку, и в трахеальную трубку вставляли ангиокатетер SURFLO 22-G (Terumo, Tokyo). Затем мышей помещали в положение для правого бокового пролежня и резецировали левые ребра, чтобы обнажить левое легкое.Мышей немедленно подключали к механическому аппарату ИВЛ MK-V100 (Muromachi Kikai, Tokyo). До конца визуализации дыхание обеспечивалось механически при следующих условиях: 55 ударов в минуту, 35 мл / мин, соотношение вдох / выдох 3: 2, изофлуран 1,5%. Чтобы уменьшить артефакты движения, вызванные дыханием, обнаженную область левого легкого осторожно отсосали и зафиксировали на покровном стекле с помощью изготовленного на заказ стабилизатора органа, который был подключен к вакуумному насосу. Опухоли в легких получали с помощью вертикального микроскопа FV1200MPE-BX61WI (Olympus), оснащенного водно-иммерсионным объективом XLPlanN 25x (Olympus), лазером InSight DeepSee (Spectra-Physics, Санта-Клара, Калифорния) и FV1200MPE Reflected Четырехканальный внешний детектор GaAsP NDD (Olympus).CFP возбуждали лазером с длиной волны 840 нм. В качестве дихроичных зеркал использовали DM450, DM570 и DM505 (Olympus). Используемые фильтры выбросов: FF01-425 / 30 (Semrock), BA460–500 (Olympus) и BA520–560 (Olympus) для SHG, CFP и FRET, соответственно. Во время визуализации FRET мышам внутривенно вводили 5,0 мг кг ^-1 PD-0325901 без прерывания визуализации.

FRET Reporter Assays для цАМФ и кальция в 96-луночном формате с использованием генетически закодированных биосенсоров, экспрессируемых в живых клетках

Реферат

Стимуляция рецепторов, связанных с G-белком (GPCR) гормонами и нейротрансмиттерами, вызывает клеточные реакции, многие из которых являются результатом изменений концентраций цитозольного цАМФ и Ca ²⁺ .Здесь мы описываем анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) микропланшетного ридера, в котором используются генетически закодированные биосенсоры h288 и YC3.60, чтобы можно было отслеживать кинетику, с которой происходят изменения [цАМФ] или [Ca ²⁺ ] встречаются в монослоях или суспензиях живых клеток, подвергнутых действию агонистов GPCR. В этом протоколе используются клеточные линии HEK293, дважды трансфицированные биосенсором FRET и представляющим интерес рекомбинантным GPCR (, например, , рецепторы глюкагона, рецепторы CCK ₂ или рецепторы NPY2R).Протокол позволяет проводить быстрый скрининг низкомолекулярных агонистов и антагонистов GPCR, а также полезен для открытия синтетических моно-, двойных и триагонистических пептидов с активирующими свойствами GPCR.

Ключевые слова: FRET, cAMP, Ca ²⁺ , GPCR, высокопроизводительный скрининг

Фон

Анализы флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) живых клеток в сочетании с микроскопией и технологиями цифровой визуализации обычно используются для мониторинга кинетики, с которой уровни цАМФ и Ca ²⁺ колеблются в ответ на стимуляцию агонистом GPCR.Здесь мы сообщаем об альтернативном подходе, который не использует микроскопию, но вместо этого позволяет обнаружение цАМФ и Ca ²⁺ на основе FRET в 96-луночном формате с использованием автоматического микроспектрофлуориметра и монослоев или суспензий живых клеток. В протоколе используются генетически закодированные биосенсоры, поэтому усредненные кинетические данные для фармакологических исследований могут быть получены в режиме реального времени с использованием считывающего устройства для микропланшетов в условиях, когда агонисты GPCR применяются в известных концентрациях. В этих анализах FRET используются клеточные линии, стабильно экспрессирующие биосенсор цАМФ h288 ( Klarenbeek et al., 2015 ) или биосенсор Ca ²⁺ YC3.60 ( Nagai et al. , 2004 г. ), оба из которых демонстрируют превосходный динамический диапазон по сравнению с более ранними репортерами FRET. Наш протокол описывает, как h288 или YC3.60 могут быть стабильно экспрессированы с рекомбинантными GPCR, так что возможен точный анализ зависимости реакции от дозы. Этот протокол основан на наших опубликованных исследованиях, в которых были обнаружены новые свойства двойных агонистов и триагонистов синтетических пептидов-агонистов GPCR (, например, , EP45 и GGP817) ( Чепурный и др., 2018 и 2019).

Используя генетически кодируемый биосенсор Epac1-camps ( Николаев и др. , 2004 г. ), мы были первыми, кто разработал анализ FRET для 96-луночного микропланшета, в котором колебания [цАМФ] отслеживались в монослоях живых клеток в режиме реального времени с помощью микроспектрофлуориметра (FlexStation 3, Molecular Devices) ( Чепурный и др. , 2009 г. ). Совсем недавно мы оптимизировали этот подход для целей открытия лекарств в режиме высокой пропускной способности. Главный технический прогресс касается использования нами h288 и YC3.60, оба из которых, как мы обнаружили, очень чувствительны к цАМФ и Ca ²⁺ соответственно. Важно отметить, что наши анализы FRET для планшет-ридера с использованием h288 или YC3.60 требуют их высокого уровня экспрессии либо путем стабильной трансфекции для создания клональных клеточных линий ( Чепурный и др. , 2018 ) или аденовирусной трансдукцией клеточных линий ( Чепурный и др. , 2018 и 2019). Временная трансфекция бесполезна, поскольку низкий уровень экспрессии этих биосенсоров несовместим с ограниченными пределами обнаружения света доступных ридеров для микропланшетов.

Для репортера h288, экспрессированного в нашей клональной клеточной линии C24 HEK293, агент, повышающий цАМФ форсколин, вызывает максимальное 100% увеличение отношения 485/535 ΔFRET, ответ, который значительно превышает значение 12%, обычно наблюдаемое при использовании Epac1-camps ( Чепурный и др. , 2009 г. и 2018). Этот клон C24 демонстрирует высокую чувствительность (EC ₅₀ 500 нМ) и отличный Z-показатель (0,77) при тестировании форсколина ( Чепурный и др. , 2018 ). Калибровку сигнала FRET получают в анализах, в которых используются клетки C24, проницаемые для дигитонина, экспрессирующие h288, и которые омываются известными концентрациями цАМФ ( Чепурный и др., 2018 ). При введении форсколина путем болюсной инъекции в отдельные лунки микропланшета, содержащего монослои клеток C24, в течение первых 30 секунд с высокой точностью отслеживают ход активации аденилатциклазы и результирующего производства цАМФ.

Мы также создали дважды трансфицированные линии клеток HEK293, которые стабильно экспрессируют h288 или YC3.60 вместе с представляющими интерес рекомбинантными GPCR. Эти GPCR включают глюкагон, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), глюкозозависимый инсулинотропный пептид (GIP), пептид YY (PYY), рецепторы высвобождающего гормона кортикотропина (CRH) и холецистокинина (CCK).Также возможно выполнить такие анализы FRET с использованием клеток HEK293, которые стабильно экспрессируют h288 или YC3.60, но вместо этого временно трансфицируются GPCR. И наоборот, можно использовать клеточную линию, которая стабильно экспрессирует рекомбинантный GPCR, так что затем клетки могут быть вирусно трансдуцированы с помощью h288 или YC3.60.

Наш кинетический анализ в реальном времени с использованием h288 и живых клеток отличается от тестов HTR-FRET с одним конечным результатом, которые отслеживают уровни цАМФ в клеточных лизатах. Например, анализ цАМФ LANCE ^® (Perkin Elmer) использует меченный европием индикатор цАМФ (донор FRET) в сочетании с меченным флуорофором антителом против цАМФ (акцептор FRET), оба из которых добавляются к реакционной смеси, так что конкуренция флуоресцентного цАМФ и нефлуоресцентного цАМФ ( i.е. , эндогенный цАМФ) для сайта связывания анти-цАМФ на антителе. Напротив, h288 является мономолекулярным, в котором цАМФ-связывающий белок Epac1 фланкирован донором FRET mTurquoise2 и акцептором FRET cp173 Венеры-Венеры, так что уменьшение FRET происходит при связывании цАМФ ( Klarenbeek et al. , 2015 ). YC3.60 вместо этого использует Ca ²⁺ -связывающий домен кальмодулина (CaM) и CaM-связывающий пептид M13 в сочетании с донором FRET ECFP11 и акцептором FRET cp173Venus, так что увеличение FRET происходит при связывании Ca ²⁺ ( Nagai et al., 2004 г. ). В отличие от тестов HTR-FRET, h288 и YC3.60 позволяют определять FRET на живых клетках в реальном времени в кинетическом режиме.

Ниже приводится подробный протокол анализа FRET, который предоставляет дополнительную техническую информацию, ранее не содержавшуюся в разделах о методах наших предыдущих публикаций ( Чепурный и др. , 2009 г. , 2018 и 2019). Мы также представляем новую информацию, касающуюся ранее неопубликованной методологии, которая позволяет изучать действие агониста GPCR в клетках, которые стабильно экспрессируют , как , рекомбинантный GPCR, так и избранный биосенсор FRET.

Разработка сенсора киназы FRET выявила активацию SnRK2 / OST1 посредством ABA, но не посредством MeJA, и высокий уровень CO2 во время закрытия устьиц

У растений протеинкиназы SnRK2 играют критическую роль в ответах на абиотический стресс (Boudsocq and Laurière, 2005; Umezawa et al., 2009; Nakashima et al., 2009; Fujita et al., 2009; Fujii and Zhu, 2009; Li et al., 2009). al., 2000; Yoshida et al., 2002; Mustilli et al., 2002). Активация протеинкиназ SnRK2 абсцизовой кислотой необходима для передачи сигнала ABA (Cutler et al., 2010; Рагхавендра и др., 2010; Чжу, 2016). Однако общий метод анализа киназы в геле SnRK2 имеет значительные ограничения для мониторинга типа клеток, клеточного компартмента и зависящей от времени активации этих протеинкиназ. Анализы киназы In-gel в замыкающих клетках Arabidopsis требуют очистки 10 ⁵ или более протопластов замыкающих клеток из более чем 100 листьев и 10 растений для каждой отдельной замыкающей клетки. Полоса анализа киназы in-gel .Измерения FRET в реальном времени активности протеинкиназы SnRK2 в интактных отдельных растительных клетках и тканях с использованием репортера SNACS позволяют напрямую исследовать ключевые биологические вопросы в реальном времени, как показано здесь.

В этом исследовании мы разработали сенсор протеинкиназы SnRK2, SNACS, содержащий субстратный домен AKS1 и полноразмерный белок 14-3-3. Киназа SnRK2.6 / OST1 фосфорилировала сенсор SnRK2 в зависимости от остатка AKS1 Ser-30 in vitro (рис. 1C), который необходим для связывания с белком 14-3-3 при передаче сигнала ABA (Takahashi et al., 2013). Анализы in vitro и in planta показывают увеличение отношения FRET в зависимости от активности киназы SnRK2 (Фигуры 1D, E и 5). Мы также наблюдали индуцированное АБК увеличение соотношения FRET в эпидермальных клетках Nicotiana benthamiana и замыкающих клетках Arabidopsis (рисунки 2 и 3). Фосфорилирование остатка AKS1 Ser-30 необходимо для связывания белка 14-3-3 с белком AKS1 (Takahashi et al., 2013). Примечательно, что мутантная изоформа сенсора AKS1 Ser-30-Ala не обнаруживает изменений соотношения FRET как in vitro, так и в растительных клетках (Фигуры 1F и 4).Эти результаты согласуются с моделью, в которой изменения в соотношении FRET происходят из конформационных изменений через связывание белка 14-3-3 с фосфорилированным доменом AKS1 в SNACS (рис. 1B). Полноразмерный белок AKS1 функционирует как фактор транскрипции в ядре. Однако домен bHLH AKS1, который важен для его функции транскрипционного фактора и ядерной локализации, был исключен из нашей сенсорной конструкции SNACS. Флуоресценция SNACS, по-видимому, наблюдается в основном в цитоплазме и в цитоплазматических пространствах между вакуолями, с возможной слабой экспрессией или отсутствием экспрессии в ядре (Рисунок 3 — приложение к рисунку 1).Будущие исследования могут нацелить SNACS на ядро ​​или другие клеточные компартменты.

ABA вызывает относительно небольшие сдвиги отношения SNACS FRET в замыкающих ячейках. Слепые эксперименты с контрольной обработкой ABA против EtOH и контроли с мутантными SNACS ^S785A и snrk2.2 / 2.3 / 2.6 тройными мутантными замыкающими клетками подтвердили ABA-ответ SNACS (рисунки 3, 4 и 5). Были разработаны сенсоры протеинкиназ для протеинкиназ, которые показывают небольшие сдвиги соотношения от 1% до 4% и используются для решения ключевых биологических вопросов (например,g.Kajimoto et al., 2019). В нашем исследовании средний ответ SNACS на АБК составил 3,7 ± 0,2% (n = 46 устьиц, ± SEM). Низкий фоновый шум в этих датчиках киназ позволил анализировать активацию и ингибирование киназ в реальном времени (Kajimoto et al. , 2019). Следовательно, из-за небольших сдвигов соотношений, непрерывные записи в отдельных клетках необходимы для разрешения зависимых от стимулов изменений FRET (Allen et al., 1999), вместо того, чтобы исследовать сравнения соотношений FRET в разных клетках за один момент времени.Получение изображений FRET с помощью SNACS позволяет получать изображения отдельных типов клеток в режиме реального времени по сравнению с необходимостью очистки очень большого количества клеток и выделения экстрактов для каждой полосы анализа киназы в геле .

Ингибитор протеинкиназы K252a, который, как известно, нарушает передачу сигналов ABA в замыкающих клетках (Schmidt et al., 1995), ингибирует индуцированное ABA увеличение FRET (рис. 6A). Кроме того, тройные мутанты snrk2.2 / 2.3 / 2.6 не показали явного изменения отношения FRET, индуцированного АБК (рис. 5D). Эти данные предполагают, что изменения соотношения FRET, вызванные ABA, зависят от фосфорилирования белка (рис. 1C).Интересно, что мы также обнаружили, что K-252a вызывает уменьшение отношения SNACS FRET, когда K252a применялся после увеличения отношения FRET, вызванного ABA (Рисунок 6C). Это согласуется с дефосфорилированием SNACS протеинфосфатазой в растительных клетках. Мы не исключаем возможность того, что K252a влияет на активность другой протеинкиназы в дополнение к активности SnRK2 (Рисунок 6 — рисунок в приложении 1). Ингибитор кальмодулина, который не ингибирует SnRK2.6 / OST1, не влиял на соотношения флуоресценции SNACS (Рисунок 6E; Рисунок 6 — приложение к рисунку 1).В ost1 / snrk2.6 одинарных мутантных замыкающих клетках и в snrk2.2 / snrk2.3 двойных мутантных замыкающих клетках ABA вызывала увеличение отношения FRET в SNACS, но не в snrk2.2 / 2.3 / 2.6 тройные мутантные замыкающие клетки (рис. 5). Кроме того, SNACS-зависимые сигналы FRET были обращены ингибиторами протеинкиназы (рис. 6). Вместе эти данные предполагают, что SNACS может сообщать о низкой базовой активности SnRK2 и что SNACS может динамически сообщать о биологических изменениях активности. HAB1 (также называемый AtP2C-HA) (Chérel et al., 2002; Саез и др., 2004; Leonhardt et al., 2004), протеинфосфатаза типа 2C, участвующая в передаче сигнала ABA, по-видимому, не дефосфорилирует остаток Ser-30 фактора транскрипции AKS1 (Takahashi et al., 2017). Фосфатазы PP2A могут дефосфорилировать AKS1 (Bu et al., 2017). K252a-индуцированное снижение соотношения SNACS FRET в замыкающих клетках свидетельствует о том, что репортер SNACS является обратимым. Потенциальная обратимость SNACS предполагает, что динамическую повышающую и понижающую регуляцию протеинкиназ SnRK2 можно исследовать в интактных растительных клетках в режиме реального времени.

Метилжасмонат (MeJA) — это растительный гормон, который участвует во многих процессах развития и важен для защитных реакций растений (Melotto et al., 2017). Однако MeJA, по-видимому, вызывает различные результаты регуляции устьиц в зависимости от условий. Опосредованное MeJA закрытие устьиц наблюдалось у нескольких видов, включая Paphiopedilum (Gehring, 1997), Vicia faba (Liu et al., 2002) и Arabidopsis (Suhita et al., 2004; Hossain et al., 2011). ; Munemasa et al., 2007; Munemasa et al., 2019; Инь и др., 2016; Förster et al., 2019). Однако в других исследованиях сообщалось, что MeJA не способствует закрытию устьиц (Montillet et al., 2013; Savchenko et al., 2014; Melotto et al., 2017; Zhu et al., 2020). Кроме того, протеинкиназа SnRK2.6 / OST1 необходима для MeJA-индуцированного закрытия устьиц из-за нарушенной MeJA-индуцированной реакции закрытия устьиц у мутантов snrk2.6 / ost1 (Yin et al., 2016). Кроме того, анализы киназы в геле и эпидермальных тканей, обогащенных замыкающими клетками, предполагают, что MeJA не активирует SnRK2.6 / OST1, хотя мутация OST1 / SnRK2.6 нарушает вызванное MeJA закрытие устьиц (Munemasa et al., 2019). В настоящем исследовании репортер SNACS не показал явного увеличения соотношений FRET в замыкающих клетках при применении 20 мкМ MeJA, что согласуется с данным исследованием с использованием эпидермальных тканей, обогащенных замыкающими клетками (Munemasa et al., 2019; Рисунок 7). Эти данные могут поддерживать недавно предложенный кальций-зависимый параллельный путь ответа MeJA (Förster et al., 2019). Сообщенный здесь датчик SNACS может быть использован для дальнейшего исследования передачи сигналов MeJA в различных условиях.

High CO ₂ и ABA запускают быстрое закрытие устьиц. Исследования газообмена, движения устьиц и регуляции ионных каналов с мутантными аллелями ost1 показали, что протеинкиназа SnRK2.6 / OST1 играет роль в закрытии устьиц, индуцированном CO ₂ (Xue et al., 2011; Merilo et al. , 2013; Hsu et al., 2018). Однако неожиданно анализы киназы в геле показали, что повышение CO ₂ не увеличивает активность SnRK2.6 / OST1 в протопластах замыкающих клеток, даже несмотря на то, что высокий CO ₂ активировал анионные каналы S-типа в той же системе (Hsu и другие., 2018). Однако оставалось неясным, может ли повышенный уровень CO ₂ активировать активность протеинкиназы SnRK2 в живых интактных замыкающих клетках. В настоящем исследовании мы использовали новый репортер SNACS для изучения передачи сигнала CO ₂ в интактных замыкающих клетках устьиц. Анализ FRET с временным разрешением в замыкающих клетках показывает, что повышение CO ₂ не вызывает измеримого увеличения отношения FRET замыкающих клеток, экспрессирующих SNACS, тогда как последующее воздействие ABA вызывало явное увеличение отношения FRET (рис. 8A и B), что дает доказательства в интактных замыкающих клетках этот высокий CO ₂ не активирует SnRK2.6 / ОСТ1 активность.

Исследования показали, что рецепторы ABA и OST1 / SnRK2.6 необходимы для закрытия устьиц дикого типа, такого как высокий уровень CO ₂ (Chater et al., 2015; Xue et al., 2011; Hsu et al., 2018 ). Классические исследования показали, что нестрессированные замыкающие клетки имеют более высокую концентрацию АБК, чем другие клетки листа (Lahr and Raschke, 1988), и совсем недавно это было показано экспериментально (Hsu et al., 2018; Yoshida et al., 2019). Для объяснения всех экспериментальных наблюдений была выдвинута гипотеза об основной активности киназы SnRK2 в нестрессированных замыкающих клетках (Hsu et al., 2018). Однако прямые измерения базальной активности SnRK2 в замыкающих клетках оказались невозможными. Интересно, что ингибитор протеинкиназы K252a вызывал явное снижение соотношения FRET репортера SNACS, а K252a ингибировал ABA-индуцированные изменения FRET в SNACS в замыкающих клетках (фиг. 6A и D). Кроме того, у тройного мутанта snrk2.2 / 2.3 / 2.6 нарушается индуцированный ABA ответ SNACS (рис. 5D). Эти данные предоставляют экспериментальные доказательства того, что протеинкиназы SnRK2 обладают базальной киназной активностью в замыкающих клетках даже в отсутствие экзогенного применения АБК.Обнаруженная здесь базальная активность SnRK2 может объяснить, почему мутантные аллели ost1 / snrk2.6 явно нарушены при закрытии устьиц, индуцированном CO ₂ (Xue et al., 2011; Hsu et al., 2018; Merilo et al. ., 2013), но повышенный уровень CO ₂ не усиливает активность OST1 / SnRK2.6 (Рисунок 8): настоящие данные предполагают, что базальная активность SnRK2, функционирующая параллельно ветви передачи сигнала CO ₂ , необходима для и / или может усилить сигнализацию CO ₂ .Более того, закрытие устьиц, вызванное высоким CO ₂ , замедляется, но не нарушается в ost1 / snrk2.6 (Hsu et al., 2018). Это контрастирует с более сильным ABA-нечувствительным ответом мутантных аллелей ost1 / snrk2.6 (Mustilli et al., 2002; Yoshida et al., 2002). Эти данные согласуются с параллельной ролью ABA и OST1 в передаче сигнала CO ₂ .

Недавнее исследование показало, что передача сигнала CO ₂ опосредуется PYL4 и PYL5, но не рецепторами PYL2 ABA (Dittrich et al., 2019). Этот вывод не может быть подтвержден в настоящем исследовании с использованием пятерых и шестерых мутантных растений по рецептору АВА более высокого порядка, которые включают нарушения генов PYL4 и PYL5 (Рисунок 9, Рисунок 9 — дополнение к рисунку 1, Рисунок 9 — приложение к рисунку 2 и Рисунок 9 — дополнение к рисунку 3). В настоящем исследовании пять линий разрушения рецептора ABA pyl-11458 и pyl-12458 были исследованы на газообмен в Dittrich et al., 2019. Однако данные для линий комплементации замыкающих клеток, представленные здесь, были основаны на pyl-11458 , тогда как данные по газообмену в Dittrich et al., 2019 были основаны на комплектации пил-12458 . Уровни экспрессии белков трансгенно экспрессируемых рецепторов могут варьироваться, влияя на интерпретацию. Таким образом, использование линий разрушения генов в настоящем исследовании позволяет сделать более надежные выводы и демонстрирует, что закрытие устьиц, вызванное CO ₂ , остается устойчивым после разрушения PYL4 и PYL5 (Рисунок 9 и Рисунок 9 — приложение к рисунку 1). Кроме того, количественные различия в уровнях экспрессии белков трансгенно экспрессируемых рецепторов ABA в замыкающих клетках и условиях роста могут влиять на результат данных устьичного ответа, учитывая актуальность найденных здесь базальных концентраций ABA и активности SnRK2.Большая скорость транспирации у пятикратного мутанта pyl-12458 была снижена за счет экспрессии замыкающих клеток PYL5 (дополнительная фигура 8C в Dittrich et al., 2019), что может быть объяснено ответом на базальную ABA. В соответствии с этой моделью, мы наблюдали замедленное открытие устьиц в pyl-11458 / PYL5 листьях (Рисунок 9 — рисунок в приложении 2D). Устьичные ответы на высокий уровень CO ₂ были затронуты и замедлены у мутантов рецептора ABA более высокого порядка pyr / pyl / rcar (Hsu et al., 2018). Однако данные для комплементации с отдельными рецепторами (Dittrich et al., 2019) могут зависеть от условий роста, поскольку настоящие независимые результаты в наших двух лабораториях (EM и HK lab и JS lab) и предыдущих исследованиях (Merilo et al., 2013 ; Hsu et al., 2018) не могут подтвердить модель, согласно которой PYL4 и PYL5 опосредуют устьичный ответ CO ₂ .

Нормализация часто используется для отображения устьичных ответов мутантов с сильно различающейся устойчивой устьичной проводимостью.Обратите внимание, что помимо сравнения зависимости устьичных ответов от времени, выводы, полученные на основе интерпретации данных нормализованной устьичной проводимости, могут быть неоднозначными. Мутанты, которые реагируют на стимуляцию, но имеют более высокую устьичную проводимость и сохраняют более высокую устьичную проводимость после ответа (что может быть связано с развитием устьиц и отверстиями), могут демонстрировать очевидное снижение чувствительности, когда данные нормализуются до значений до начала стимул. Например, в настоящем исследовании анализ нормализованных данных по устьичной проводимости привел бы к неточным выводам: например, когда анализировались данные о устьичной проводимости с рисунка 9, но в нормализованных относительных единицах, то есть путем деления абсолютного снижения устьичной проводимости на устьичная проводимость в начале повышенного CO ₂ , выводы, противоположные анализу ненормализованных данных, могут быть сделаны (Рисунок 9 — рисунок в приложении 1): после нормализации шестиместный мутант PYR / RCAR и пятерка pyl-11458 мутант имел наименьшее нормализованное снижение устьичной проводимости в ответ на повышение CO ₂ (Рисунок 9 — рисунок в приложении 1).Однако, в отличие от тех же данных, абсолютные значения устьичной проводимости показывают самые сильные ответы CO ₂ у рецептора ABA , pyl-12458, , пятерки и pyl-112458, , шестикратных мутантов (рис. 9A и B, рис. 9 — рис. приложение 1). Эти анализы показывают, что для количественного определения чувствительности устьиц линий растений с различной начальной устьичной проводимостью к стимулам необходимо применять различные кинетические анализы, основанные на ненормированных устьичных проводимости в реальном времени.Отображение как абсолютных, так и нормализованных данных рядом (Hsu et al., 2018) или предоставление значений устьичной проводимости в установившемся состоянии может помочь в разработке более надежных механистических моделей.

В заключение, SnRK2 являются ключевыми протеинкиназами, которые опосредуют реакции на абиотический стресс. В совокупности представленное исследование обеспечивает новый подход к изучению активности киназы SnRK2 в реальном времени и стрессовых реакций в живых интактных растительных клетках и тканях. Репортер SNACS можно использовать для исследования многих моделей передачи сигналов стресса и перекрестных помех между путями (Yoshida et al., 2006; Wang et al., 2018; Такахаши и др., 2020; Lin et al., 2020). Более того, субклеточное нацеливание на SNACS д. Быть интересным для будущих сравнений регуляции протеинкиназы SnRK2, локализованной в клеточных компартментах. Кроме того, мы приводим доказательства обратимости SNACS in vivo при ингибировании активности киназы, предполагая, что также можно проанализировать подавление регуляции протеинкиназы SnRK2. Более того, как повышенный уровень CO _2, , так и MeJA не вызывают увеличения коэффициента испускания флуоресценции SNACS, что дает экспериментальные доказательства того, что эти стимулы не усиливают быстро SnRK2.6 / активность OST1 в замыкающих клетках, как обнаружено здесь при анализе в реальном времени. Более того, наши анализы газообмена интактных растений и листьев не смогли подтвердить недавно предложенную модель, согласно которой устьичная передача сигналов CO ₂ требует рецепторов PYL4 и PYL5 ABA (Dittrich et al.