Фото лады х рей: LADA XRAY кроссовер — Официальный сайт LADA

(AP) — Бедные пользователи Instagram. Во-первых, их любимое приложение для обмена фотографиями переходит от эксклюзивности только для iPhone к массам телефонов Android. Неделю спустя Facebook поглощает крошечный стартап, стоящий за приложением, за 1 миллиард долларов.Покупка вызвала опасения, что Facebook может закрыть Instagram или изменить его к худшему, собирая их личную информацию или помещая рекламу в свои тщательно отобранные фотопотоки.

«Я очень старался не быть частью экосистемы Facebook», — говорит Дарвин Поблете, архитектор из Бруклина, Нью-Йорк, который использовал Instagram с первых дней его существования. «Теперь я чувствую, что покупка меня затянула.Мне нужно будет посмотреть, как изменятся настройки конфиденциальности, чтобы решить, оставлю ли я их ».

Instagram привлек более 31 миллиона пользователей менее чем за два года. Его почти культовыми последователями были лояльные пользователи iPhone, которые стекались к приложению из-за его простоты использования, игривых фильтров, которые могут сделать даже скучные фотографии художественными, а также отсутствия рекламы, обновлений статуса и прочего беспорядка. Apple назвала Instagram приложением года для iPhone в 2011 году.

Честно говоря, и генеральный директор Facebook Марк Цукерберг, и генеральный директор Instagram Кевин Систорм стремились заверить людей, что приложение никуда не денется.По словам генеральных директоров, в отличие от всех других стартапов, купленных Facebook, Instagram останется доступным для людей, которые не используют Facebook или не хотят подключать его к своим учетным записям в самой густонаселенной социальной сети в мире.

«Миллионы людей во всем мире любят приложение Instagram и связанный с ним бренд, и наша цель — помочь распространить это приложение и бренд среди еще большего числа людей», — написал Цукерберг на своей странице в Facebook, объявив о покупке в понедельник.

Однако трудно сказать, что Facebook может сделать через год или два.В конце концов, постоянная эволюция сайта стала главной причиной его успеха. Делать что-то по-старому только потому, что несколько пользователей жалуются, — это не то, что нравится Facebook.

Для Саманты Хатмахер перемены не обязательно плохо. Студент колледжа, который использует и Facebook, и — с прошлой недели — Instagram, говорит, что если Facebook настроит приложение, «я полагаю, оно будет более креативным».

Хотя многие люди жалуются, что Facebook вносит изменения в свой сайт, Хутмахер говорит, что она «не может указать конкретное время», когда ей хотелось бы, чтобы на ее странице в Facebook не было новых функций, которые компания добавила за эти годы.

«Это как бы растет на тебе», — говорит Хатмахер, изучающий начальную школу в Университете Миссури в Колумбии, штат Миссури.

Instagram уже немного похож на Facebook, но без шума обновлений статуса, ссылок, рекламы, видео и игр. Это часть его привлекательности и большая часть того, почему Facebook посчитал его настолько серьезной угрозой, что заплатил 1 миллиард долларов за его покупку.

«Они безумно растут на мобильных устройствах, а мобильная платформа Facebook (включая ее приложение) в лучшем случае посредственна», — написал технический блоггер Ом Малик во вторник на GigaOm. «Facebook не является компанией, ориентированной прежде всего на мобильные устройства, и они не думают с точки зрения мобильных устройств. Внутренняя идеология Facebook — это интернет-компания, ориентированная на настольные компьютеры».

Instagram — социальная сеть только для фотографий, но даже они разные. Пользователи, кажется, больше думают и заботятся о фотографии в Instagram, чем о типичном снимке с Facebook.Это не ваши групповые снимки, помеченные именами всех присутствующих, и не бесконечно пересылаемые фотографии котят с прикрепленными к ним забавными цитатами. Вместо этого пользователи с большей вероятностью поделятся, скажем, фотографией чашки чая с наложенным на нее фильтром, поэтому похоже, что она была сделана пленочной камерой 30 лет назад. Дети — тоже популярные предметы, как тюльпаны и пасхальные яйца в сезон.

Деб Джонсон из Лонг-Бич, Калифорния, любит публиковать фотографии своих собак, двух родезийских риджбеков.Она также публикует снимки еды, которую она ест, совсем недавно блюдо из шотландского лосося, которое она ела в ресторане. По ее словам, чтобы ценить Instagram, «вам действительно нужно ценить визуальный опыт».

«Сегодня я сфотографировал какую-то глупость», — говорит Джонсон, который работает в сфере информационных технологий, тестируя системы для страховых компаний. Кто-то в ее доме поместил маленький диспенсер Cookie Monster Pez внутрь большего диспенсера Cookie Monster Pez, сделав своего рода диспенсер-диспенсер Pez.Итак, Джонсон сделал фото. Instagram настолько прост в использовании, что появляются именно такие изображения. Чтобы опубликовать изображение в Instagram, достаточно всего трех касаний пальцем.

«Существуют сотни тысяч приложений. Не нужно создавать приложения, и они появятся», — говорит Ребекка Либ, аналитик Altimeter Group. «Ценник говорит о том, что в Instagram не обошлось и без других ухажеров».

Другими словами, Facebook не просто купил какую-либо компанию.

«Если кто-то сможет разлить в бутылки свой рецепт успеха, я гарантирую, что они это сделают.Он прост в использовании, работает очень хорошо и добавляет дополнительный уровень функциональности (с фильтрами), — говорит Либ. — Все это в совокупности создает моджо, которым является бренд. Почему не каждый безалкогольный напиток Кока-Кола? Потому что это не так ».

Instagram напоминает другое элегантное, простое в использовании приложение, которое быстро привлекло множество пользователей — Pinterest. Обе компании используют желание людей делиться маленькими жизненными моментами по мере их появления. И оба предоставляют пользователям более простую и менее шумную социальную сеть, чем Facebook.

«Есть много интересных социальных сетей, — говорит аналитик Gartner Брайан Блау. «И это конкуренты Facebook. Один вокруг фотографий, (это) одна из самых популярных вещей, которые мы делаем. Это идеальное дополнение к Facebook».

Facebook будет заключаться в том, чтобы сделать лояльных пользователей Instagram счастливыми, даже если сервис расширяется и включает гораздо больше людей.

«Мы уже видели, как это происходило раньше, когда Facebook открывал свою членскую базу от (студентов) для всех», — говорит Либ.

Люди ворчали в то время, что это был конец Facebook. Это было не так.

«Людям не нравятся перемены, но поведение пользователей указывает на то, что люди примут изменения», — говорит она.

© 2012 Ассошиэйтед Пресс.Все права защищены. Этот материал нельзя публиковать, транслировать, переписывать или распространять.

Цитата : Лояльные пользователи Instagram обеспокоены охватом Facebook (2012, 10 апреля) получено 26 июля 2021 г. с https: // физ.org / news / 2012-04-loyal-instagram-users-fret-facebook.html

Этот документ защищен авторским правом. За исключением честных сделок с целью частного изучения или исследования, никакие часть может быть воспроизведена без письменного разрешения. Контент предоставляется только в информационных целях.

Дифференциальная динамика RhoA в мигрирующих и неподвижных клетках, измеренная с помощью FRET и автоматизированного анализа изображений

Abstract

Генетически закодированные биосенсоры на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) широко применяются для изучения пространственно-временной регуляции молекулярной активности в живых клетках с высоким разрешением.Эффективная и точная количественная оценка большого количества данных изображений из этих одноклеточных измерений FRET требует надежного и автоматизированного анализа данных. Однако нелинейное движение живых клеток представляет собой огромную проблему для решения этой задачи. Основываясь на регистрации изображения движения отдельной клетки, мы разработали автоматизированные методы анализа изображений для отслеживания и количественной оценки сигналов FRET в определяемых пользователем субклеточных областях. Кроме того, субклеточные пиксели были классифицированы в соответствии с их связанными сигналами FRET и динамикой анализируемых кластеров.Результаты показали, что индуцированное EGF снижение активности RhoA в мигрирующих клетках HeLa значительно меньше, чем в неподвижных клетках. Более того, активность RhoA поляризована в мигрирующих клетках с градиентом полярности, ориентированным в противоположном направлении миграции клеток. Напротив, отсутствует постоянное предпочтение полярности RhoA среди стационарных клеток. Таким образом, наши методы анализа изображений могут предоставить мощные инструменты для высокопроизводительного и систематического исследования пространственно-временной молекулярной активности в регулировании функций живых клеток с их формами и положением, непрерывно меняющимися во времени.

Образец цитирования: Eichorst JP, Lu S, Xu J, Wang Y (2008) Дифференциальная динамика RhoA в мигрирующих и стационарных клетках, измеренная с помощью FRET и автоматического анализа изображений. PLoS ONE 3 (12): e4082. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082

Редактор: Терри Минс, Массачусетская больница общего профиля / Гарвардский университет, США

Поступила: 6 ноября 2008 г .; Принято: 26 ноября 2008 г .; Опубликовано: 30 декабря 2008 г.

Авторские права: © 2008 Eichorst et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была частично поддержана отделом биоинженерии Иллинойского университета, Урбана-Шампейн, Фондом Уоллеса Х. Култера, Beckman Laser Institute Inc., грантом NSF 08-00870 и грантом NIH NS- 063405. Финансирующие агентства не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Миграция клеток играет важную роль в эмбриональном развитии, восстановлении тканей, инвазии рака и атеросклерозе [1]. Это высокоинтегрированный процесс, модулируемый множеством сигнальных путей, состоящий из расширения цитоскелета и образования фокальных комплексов спереди, а также разборки фокальной адгезии и сокращения цитоскелета сзади [1].Семейство малых Rho GTPases играет ключевую роль в регуляции актинового цитоскелета и, следовательно, миграции [1] — [3]. Эти GTPases функционируют как молекулярные переключатели в клетке, чередуя активные GTP-связанные и неактивные GDP-связанные состояния, опосредованные факторами обмена гуаниновых нуклеотидов (GEFs) и белками, активирующими GTPase (GAPs), соответственно [1] — [4]. Среди известных представителей малых Rho GTPases, таких как RhoA, Rac1 и Cdc42 [2], [3], RhoA, как сообщается, опосредует сборку сократительных актомиозиновых филаментов в задней части мигрирующих клеток через один из его нижестоящих эффекторов, ROCK [3] — [5].Следовательно, было высказано предположение, что активность RhoA может концентрироваться в хвосте мигрирующих клеток [3]. Однако при использовании биосенсоров, основанных на флуоресцентном резонансном переносе энергии (FRET) [6], недавно было обнаружено удивительно высокая активность RhoA, которая присутствует не только в хвосте, но также и в передней части мигрирующих клеток [7], [8]. Эти результаты предполагают, что RhoA может выполнять разные функции в разных субклеточных местоположениях.

FRET — это явление квантовой механики. Когда два флуоресцентных белка (FP), донор и акцептор, находятся рядом с благоприятной ориентацией, возбуждение донорного FP может вызвать излучение от акцептора [9].FRET позволил разработать множество биосенсоров, способных обнаруживать молекулярную активность или белок-белковые взаимодействия в живых клетках [10], [11]. Два биосенсора RhoA на основе FRET были разработаны для визуализации пространственно-временной динамики активности RhoA в живых клетках [7], [12]. Группа Мацуда разработала биосенсор RhoA (Raichu-RhoA), который содержит RhoA (аминокислота 1–189), гибкий линкер и RhoA-связывающий домен (RBD) из его молекулы субстрата PKN, соединенный между голубым и желтым флуоресцентным светом. белок (CFP и YFP) [12].Активация RhoA может вызывать внутримолекулярное связывание между RhoA и доменом RBD в биосенсоре. Результирующее конформационное изменение может приблизить CFP и YFP и усилить сигналы FRET. Биосенсор Raichu-RhoA позволяет отслеживать активность RhoA во время деления клеток, поляризации и обмена фокальной адгезии в различных клетках [8], [12] — [15]. Другой биосенсор FRET RhoA был независимо разработан, содержащий последовательно полноразмерный RhoA, CFP, гибкий линкер, YFP и домен RBD ротекина [7].Этот биосенсор также успешно применялся для изучения различных клеточных функций, включая миграцию и полярность во время хемотаксиса [7], [16], [17].

Хотя разработка биосенсоров FRET значительно расширила наши знания о передаче сигналов в живых клетках, огромное количество данных визуализации, производимых этими биосенсорами, требует автоматических, интеллектуальных и объективных инструментов анализа изображений, позволяющих точную и эффективную интерпретацию биологической информации [ 18]. В частности, очень необходимы эффективные алгоритмы для отслеживания движения ячеек и учета различий в форме и геометрии отдельных ячеек.

Регистрация изображений широко применяется в технике и науке для автоматического отслеживания движущихся объектов во времени и для нахождения пиксельного соответствия между двумя изображениями похожих объектов [19], [20]. При анализе изображений живых клеток этот метод использовался для выравнивания, посредством простого переноса и вращения, флуоресцентных изображений на разных длинах волн [21] — [23] и изображений ядра в разные моменты времени одной и той же клетки [24]. Его также применяли для отслеживания флуоресцентных частиц внутри клеток [25].Более сложные методы регистрации изображений также применялись для анализа экспрессии генов in situ в мозге мышей [20]. Другие методы количественной оценки были разработаны для изучения распределения белка и полярности молекулярной активности путем разделения всей клетки на небольшие клинья в полярно-скоординированной системе [23], [26] — [28], чтобы изучить подвижность и энергию одиночных сперматозоидов путем отслеживания и улавливания [29], [30] или для извлечения данных о трехмерной анатомии сосудов [31]. Тем не менее, автоматическая регистрация движущихся клеток изображения целой клетки с помощью пиксельного отслеживания по-прежнему остро нуждается в высоком разрешении и эффективном количественном определении молекулярных сигналов в пространстве и времени.

В этой статье мы разработали автоматизированные методы анализа изображений для отслеживания движения отдельных клеток и количественной оценки сигналов FRET в субклеточных регионах с использованием биосенсора RhoA от доктора Мацуда [12]. Пространственно-временные паттерны активации RhoA были проанализированы в мигрирующих и неподвижных клетках HeLa в ответ на стимуляцию фактором роста. Наши результаты показывают, что глобальная активность RhoA в мигрирующих клетках подавляется в ответ на стимуляцию факторами роста в меньшей степени, чем в стационарных клетках.Активность RhoA была более сконцентрирована в противоположном направлении миграции в мигрирующих клетках, но не проявляла предпочтения в стационарных клетках.

Материалы и методы

Клеточные линии и культура

HeLa (ATCC, Манассас, Вирджиния) культивировали в увлажненном 95% воздуха, 5% CO. ₂ инкубаторе при 37 ° C. Культуральная среда представляла собой среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1 ед. / Мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 1 мМ пирувата натрия.Реагенты для клеточных культур были получены от Invitrogen (Сан-Диего, Калифорния).

Переходная трансфекция и микроскопическая визуализация

Поскольку биосенсор Raichu-RhoA может быть легко трансфицирован и хорошо охарактеризован для клеток HeLa, мы использовали этот биосенсор для визуализации динамики активности RhoA в клетках HeLa на стекле, покрытом фибронектином [12]. Биосенсор Raichu-RhoA трансфицировали в HeLa с помощью липофектамина (Invitrogen) [12] перед голоданием с 0,5% FBS в течение 36–48 часов.Затем клетки суспендировали в трипсин-ЭДТА и высевали на покрытые фибронектином чашки со стеклянным дном на 3-6 часов перед стимуляцией EGF (50 нг / мл). Во время визуализации клетки содержали в CO ₂ -независимой среде без сыворотки (Invitrogen) при 37 ° C. Объективный фокус был нацелен вблизи базальной стороны клетки. Изображения были получены с помощью аксиовертного инвертированного микроскопа Zeiss с фильтром возбуждения 420DF20, дихроичным зеркалом 450DRLP, двумя фильтрами излучения, управляемыми устройством смены фильтров (480DF30 для CFP и 535DF25 для YFP) и охлаждаемой камерой устройства с зарядовой связью (Cascade 512B; Фотометрия).Интенсивность возбуждающего света контролировалась регулируемыми фильтрами нейтральной плотности для обеспечения минимального фотообесцвечивания во время визуализации. Из изображений интенсивности флуоресценции CFP и YFP вычитали фон. Изображения отношения FRET были рассчитаны путем вычисления пиксельного отношения CFP / YFP для представления активности RhoA в пространстве и времени с использованием программного обеспечения MetaFluor 6.2 (Universal Imaging) или наших индивидуальных программ, разработанных в MATLAB (MathWorks).

Регистрация изображения

Чтобы автоматически регистрировать покадровые изображения движущейся клетки, мы отображали эти изображения клеток на единичный диск, который служил эталонным изображением как для регистрации последовательности покадровых изображений одной и той же клетки, так и для сравнения между ними. разные клетки различной формы.Чтобы сопоставить ячейку с единичным диском, потребовалось четыре шага. Сначала с помощью сегментации определяли тело клетки. Во-вторых, контрольные точки на ячейке были вычислены с помощью триангуляции Делоне выпуклой оболочки тела ячейки. В-третьих, контрольные точки были сопоставлены с эталонным изображением (единичным диском) путем вычисления относительного положения точек в выпуклой оболочке. Наконец, ячейки были отображены в единичный диск с помощью кусочно-линейного преобразования [32], определяемого контрольными точками и триангуляцией Делоне (рис. 1).

Рис. 1. Диаграммы, изображающие алгоритм отслеживания региона.

(A) Центроид ячейки ( C ), контрольная точка ( P ) и граница пересечения в выпуклой оболочке ( E , на левом изображении) использовались для вычисления относительного расстояния и ориентация вектора, указывающего от центроида до контрольной точки. ( r , θ ) — полярные координаты точки на единичном диске ( P ‘), соответствующей контрольной точке ( P ) в изображении ячейки (правое изображение).(B) Процесс регистрации показан слева направо. Сначала ячейка разбивается на треугольную сетку внутри ее границы. Во-вторых, сетка была сопоставлена ​​с единичным кругом путем вычисления относительного расстояния и ориентации векторов, указывающих от центроида до узлов сетки (или контрольных точек). Наконец, контрольные точки и изображение ячейки были отображены на единичный диск с помощью кусочно-линейной интерполяции внутри треугольной сетки. (C) Верхние панели показывают изображения одной клетки, подвергающейся расширению или перемещению, с выбранной областью интереса в первом кадре.На нижних панелях показаны единичные диски, преобразованные из ячейки в разные моменты времени. Граница преобразованной области интереса в первом кадре используется для отслеживания и количественной оценки сигналов из одной и той же области на этих различных единичных дисках.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g001

Метод Оцу [33] был использован для вычисления порога интенсивности для сегментации тела клетки, поскольку флуоресцентные изображения, записанные с помощью биосенсора RhoA, были яркий и легко отделяемый от фона.Список узлов, очерчивающих контур клетки, был создан на основе идентифицированного тела клетки. Таким образом, внутри контура было создано изображение маски, чтобы представить форму ячейки. Изображения, собранные из канала YFP, использовались для обнаружения края ячейки и маски, поскольку они были ярче, чем изображения из канала CFP.

Чтобы зафиксировать форму ячейки единичным диском без неоднозначности, требуется, чтобы форма ячейки была выпуклой. Поэтому выпуклая оболочка, описывающая изображение маски ячейки, была вычислена [34] и использована в качестве границы для вычисления триангуляции Делоне [35].Затем узлы триангуляции использовались в качестве контрольных точек для изображения ячейки. Для каждой контрольной точки на изображении ячейки соответствующая контрольная точка в единичном диске была рассчитана на основе ее относительного положения в выпуклой оболочке. Вкратце, центроид ячейки () был сопоставлен с центром единичного диска () (рис. 1А). Для любой другой контрольной точки (), соответствующая точка на единичном диске, была вычислена на основе относительного положения точки между центроидом и краем выпуклой оболочки.Предположим, есть полярные координаты () с центром в центроиде; и луч от до пересекает край выпуклой оболочки в точке. Тогда полярные координаты соответствующей точки () в единичном круге задаются выражением () с центром в, где представляет относительное расстояние от до, т.е. (рис. 1A – B). И наоборот, любая точка на единичном диске может быть отображена обратно в разные ячейки или в одну и ту же ячейку с разными формами в разные моменты времени.

Выпуклая оболочка всей ячейки отображалась на единичный круг кусочно-линейным преобразованием [32].Внутри каждого треугольника в триангуляции Делоне преобразование является линейным и однозначно определяется тремя контрольными точками, которые являются узлами треугольника (рисунок 1B). Преобразование также непрерывно на краях, общих для двух треугольников.

Отслеживание областей интереса (ROI)

Чтобы отслеживать интересующие области, покадровые изображения одной клетки сначала преобразовывались в серию единичных дисков. Затем пользователь выбрал и определил одну или несколько областей интереса на первом изображении ячейки.После этого была сгенерирована маска для области интереса и сопоставлена ​​с первым единичным диском с помощью нашего метода регистрации изображений. Для отслеживания среднего сигнала FRET в этой области предполагалось, что маска области интереса на единичном диске остается в том же месте во времени (рис. 1C). Таким образом, одна и та же маска может быть применена ко всем единичным изображениям диска для отслеживания и расчета временного хода среднего отношения FRET в выбранной области (ах), которое было вычислено путем взятия отношения общей интенсивности CFP и YFP в пределах области. (s) в ячейке (рисунок 1C).Предположение о постоянных областях интереса в дисках эталонных единиц является точным, если клетки перемещаются только в плоскости визуализации или сжимаются / расширяются в радиальных направлениях, идущих от центроида. Ожидается, что клетки не будут вращаться вокруг своих центроидов в ходе эксперимента. Эти предположения являются разумными для клеток с медленной миграцией в пределах временного окна наших экспериментов и согласуются с моделью градиентного радиального расширения (GRE) [36], где ожидается, что клетки будут вытягивать или втягивать свои ламеллиподии локально перпендикулярно краю клетки и вдоль актиновые волокна.

Области интереса на эталонном единичном диске были сопоставлены с исходными изображениями ячеек, чтобы визуально подтвердить, что они действительно могут отслеживать фактическую область в мигрирующих ячейках (рис. 1С). Для повышения эффективности вычислений только узлы, очерчивающие ROI на единичном диске, но не всю маску, были преобразованы обратно в изображения ячеек.

Кластерный анализ

Чтобы изучить геометрические особенности субклеточных регионов со сходными уровнями активности RhoA, пиксели изображения клетки были классифицированы и разделены на шесть кластеров в соответствии со значениями их отношения RhoA FRET.Функция MATLAB kmeans использовалась для классификации пикселей в различные кластеры, минимизируя внутрикластерные вариации значений FRET [37], [38]. В результате каждый кластер содержал пиксели с одинаковыми значениями отношения FRET.

Программы MATLAB, реализующие эти функции, можно получить, написав соответствующему автору этой статьи.

Результаты

Регистрация изображения

В ходе экспериментов наблюдались два класса клеток HeLa со значительно различающимися паттернами миграции: мигрирующие и стационарные.Чтобы определить, является ли клетка HeLa мигрирующей или неподвижной, местоположение ее центроида отслеживалось во времени. Наибольшее расстояние, пройденное центроидом от исходного положения, было разделено на сумму расстояний, пройденных на каждом временном шаге в течение примерно 60 минут в каждом эксперименте. При соотношении больше или равном 0,5 клетка считалась мигрирующей. В противном случае ячейка считалась стационарной. Результаты подтвердили, что четко существует два класса клеток HeLa с соотношением расстояний, равным 0.71 и 0,1867 (таблица 1). Направление миграции каждой мигрирующей клетки можно определить по траектории ее центроида путем линейной аппроксимации.

С помощью нашего метода регистрации изображений, внутриклеточная активность RhoA при стимуляции фактором роста может быть визуализирована в рамках единого кадра эталонного изображения (рис. 2). Активность RhoA была высокой как на переднем, так и на заднем крае мигрирующих клеток (Рисунки 2A – 2B). Это подтвердило, что RhoA вносит вклад в удлинение актиновых филаментов и сборку мембран на фронте клетки посредством mDia, тогда как регулирует сократимость актомиозина в задней части клетки [2].Как в мигрирующих, так и в неподвижных клетках можно четко наблюдать пространственные паттерны двух концентрических кольцеобразных субклеточных структур с высокой активностью RhoA (Figure 2 and Movie S1). Внешнее кольцо с высокой активностью RhoA может отражать возникающую и динамическую активацию интегрина при активности RhoA [39]. Высокая активность RhoA во внутреннем кольце может указывать на относительно высокий стресс, возникающий в конвергентной зоне, где ретроградный поток актина ламеллы встречается с антероградным потоком актина тела клетки [40].Несмотря на эти отличительные субклеточные особенности, общая активность RhoA как мигрирующих, так и немигрирующих клеток HeLa снижалась после стимуляции EGF (Рисунок 2 и Movie S1). Похоже, что после стимуляции EGF активность RhoA оставалась относительно стабильной в задней части мигрирующих, но не стационарных клеток (рис. 2B и Movie S1).

Рис. 2. Изображения FRET и их преобразованные карты на единичных дисках биосенсора Raichu-RhoA (Venus / ECFP) в мигрирующих и неподвижных клетках.

Панель (A) показывает последовательность покадровых изображений FRET для репрезентативной мигрирующей клетки HeLa. Белая стрелка указывает направление миграции. Панель (B) показывает изображения FRET мигрирующей клетки в (A), преобразованные в единичный диск. Пространственно-временная динамика изображений FRET движущейся клетки HeLa также показана в фильме S1. Панель (C) показывает последовательность покадровых изображений FRET для репрезентативной стационарной клетки HeLa. Панель (D) показывает изображения FRET неподвижной ячейки в (B), преобразованные в единичный диск.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g002

Отслеживание областей интересов

Для отслеживания и количественной оценки локальной активности RhoA в субклеточных регионах в клетках HeLa было выбрано четыре ROI как в мигрирующих, так и в неподвижных клетках. Четыре области интереса в мигрирующих ячейках охватывают переднюю, заднюю и две стороны ячейки (рис. 3A и ролик S2). Поскольку область интереса может выходить за пределы тела ячейки (рис. 3A, область 1), пороговое значение изображения YFP ячейки использовалось для оценки и вычисления сигнала FRET в части области интереса внутри тела ячейки.Таким образом, средние отношения FRET в пределах каждой области интереса мигрирующих клеток в разные моменты времени были рассчитаны для мониторинга динамической активности RhoA в субклеточных местах (рис. 3B). Оказалось, что активность RhoA во всех четырех регионах сразу упала и немного восстановилась после стимуляции EGF. Затем местная активность RhoA непрерывно снижалась в регионах на передовой и с обеих сторон. Однако в области около заднего края мигрирующей клетки активность RhoA оставалась относительно постоянной без значительного подавления после стимуляции EGF (Рисунок 3B).Это характерная особенность для различных проанализированных мигрирующих клеток. В результате разница между активностью областей интереса в передней и задней части ячейки показала значительное увеличение для мигрирующих ячеек. Это открытие подтверждает предыдущее исследование, что высокая активность RhoA важна в обеспечении сокращения хвоста мигрирующих клеток [2].

Рисунок 3. Отслеживание и анализ активности RhoA в различных областях интереса мигрирующей клетки HeLa.

(A) Слева: в первом кадре были выбраны четыре области интереса для мониторинга активности RhoA на передней, задней и двух сторонах мигрирующей ячейки.Справа: вычисленные контуры и местоположения областей интереса в ячейке в разные моменты времени на основе нашего алгоритма отслеживания. Покадровые изображения автоматически отслеживаемых областей интереса также показаны в фильме S2. (B) Временные зависимости соотношений FRET биосенсора Raichu-RhoA, усредненные по четырем областям интереса, показанным на (A).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g003

В стационарных ячейках, поскольку ячейки не двигались значительно, позиции ROI оставались относительно неизменными во времени (рис. 4A).Активность RhoA во всех четырех регионах сразу упала и немного восстановилась, прежде чем продолжить снижение после стимуляции EGF. В отличие от субклеточных различий активности RhoA, наблюдаемых в мигрирующих клетках, активность RhoA во всех четырех областях интереса стационарных клеток, по-видимому, снижалась с аналогичной кинетикой при стимуляции EGF (фиг. 4).

Рис. 4. Отслеживание и анализ активности RhoA в различных областях интереса стационарной клетки HeLa.

(A) Слева: в первом кадре были выбраны четыре области интереса для мониторинга активности RhoA на передней, задней и двух сторонах стационарной ячейки.Справа: вычисленные контуры и местоположения областей интереса в ячейке в разные моменты времени на основе нашего алгоритма отслеживания. (B) Временные зависимости соотношений FRET биосенсора Raichu-RhoA, усредненные по четырем областям интереса, показанным на (A).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g004

Из-за относительно стабильной активности RhoA в хвосте мигрирующих клеток при стимуляции EGF ожидалось, что глобальная активность RhoA в мигрирующих клетках будет снижаться медленнее. чем у стационарных ячеек.Следовательно, мы количественно оценили глобальную активность биосенсора RhoA в мигрирующих и неподвижных клетках, взяв среднее значение активности RhoA во всех четырех областях интереса и нормализовав в соответствии с их отношениями до EGF. Результаты подтвердили, что активность RhoA снижалась как в мигрирующих, так и в неподвижных клетках после EGF, с более медленной скоростью в мигрирующих клетках, чем в неподвижных клетках (фиг. 5). Разница между нормализованными соотношениями биосенсора RhoA в мигрирующих и неподвижных клетках стала статистически значимой через 13–26 минут после стимуляции EGF (рис. 5), что соответствует времени, когда активность RhoA в хвосте мигрирующих клеток начала показывать разницу. из других субклеточных регионов (~ 25 минут после EGF на рисунке 3B).Эта разница между мигрирующими и неподвижными клетками продолжала увеличиваться во времени после стимуляции EGF (рис. 5). Эти результаты показывают, что активность RhoA в мигрирующих клетках при стимуляции EGF регулируется по-разному, по сравнению с активностью в неподвижных клетках, возможно, из-за относительно высокой активности RhoA в задней части мигрирующих клеток после стимуляции EGF.

Рисунок 5. Глобальная активность RhoA в мигрирующих и неподвижных клетках HeLa в разные моменты времени до и после стимуляции EGF.

Активность RhoA, усредненная по четырем областям интереса, охватывающим все тело клетки, была использована для представления глобальной активности RhoA. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку, а звездочками отмечены моменты времени, когда средние активности RhoA значительно различались (t-тест, p <0,05) между мигрирующими и неподвижными клетками.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g005

Кластерный анализ

Мы дополнительно изучили геометрические особенности субклеточных областей с относительно высокой активностью RhoA после стимуляции EGF.Внутриклеточные пиксели изображения FRET были разделены на шесть кластеров в соответствии с их значениями отношения FRET. Как показано на рисунке 6A, пиксели изображения были закодированы по цвету в зависимости от кластера, которому они принадлежат, в порядке от синего к красному в соответствии со средним соотношением RhoA FRET в каждом кластере в диапазоне от низкого до высокого. Были отобраны три верхних кластера с наивысшим соотношением FRET и проведен мониторинг для изучения распределения высокой активности RhoA и их влияния на поведение клеток, например миграция (рисунки 6 и ролик S3).Программа MATLAB была разработана для автоматического выбора и количественной оценки площади этих регионов (рис. 6). Результаты показали, что размер области этих выбранных областей увеличивался со временем после стимуляции EGF, особенно в задней части мигрирующих клеток (рис. 6C). Чтобы количественно проанализировать размер этих областей с высокой активностью RhoA, была установлена ​​полярная система координат с центром в центроиде каждой клетки. Затем ячейка была разделена на 18 угловых клиньев с шагом 20 ° (рис. 6В).Было вычислено количество пикселей во всем секторе,, а также количество пикселей в трех кластерах с высоким RhoA в секторе. Нормализованное количество пикселей в каждом сегменте вычислялось как отношение. Нормализованное количество пикселей в каждом клине наносили на график в зависимости от угла клина, чтобы представить полярность активности RhoA. Как показано на фиг. 6D, эта кривая полярности репрезентативной мигрирующей клетки HeLa в разные моменты времени ясно демонстрирует повышенную пространственную полярность RhoA, инициированную стимуляцией EGF.Пиксели с относительно высокой активностью RhoA, по-видимому, накапливались в области, противоположной направлению миграции, примерно под 220 ° в координатах на Фигуре 6B.

Рисунок 6. Кластерный анализ активности RhoA в репрезентативной мигрирующей клетке.

(A) Шесть субклеточных регионов с различными активностями RhoA были вычислены с использованием кластерного анализа K-средних. Эти области имеют цветовую кодировку в соответствии с их активностями RhoA, причем холодные и горячие цвета указывают на низкий и высокий уровни активности RhoA соответственно.Направление миграции указано белой стрелкой. (B) Выбраны и продемонстрированы три области с самыми высокими отношениями RhoA FRET из панели (A). Белые пунктирные линии очерчивают клин в ячейке. Система координат, используемая для полярного анализа, показана в правом нижнем углу. (C) Покадровые изображения, показывающие три кластера с высоким соотношением FRET до и после стимуляции EGF. На вставке выделено положение кластера с самым высоким соотношением FRET, который обычно находится на самом краю ячейки.(D) Ячейка была разделена на 18 клиньев, как показано на панели (B). Количество пикселей в трех кластерах с наивысшим соотношением FRET в каждом секторе было нормализовано путем деления общего количества пикселей сектора. Это нормализованное количество пикселей с высоким FRET на клин отображается в зависимости от угла клина. Динамическое поведение автоматически обнаруженных кластеров также показано в Movie S3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g006

Аналогичный кластерный анализ был проведен на стационарных ячейках.Репрезентативная стационарная сота с шестью кластерами имеет цветовую кодировку в соответствии с соотношением FRET и изображена на рисунке 7A, причем три самых высоких кластера и их покадровые изображения показаны на рисунках 7B и 7C соответственно. Нормализованное количество пикселей клина под разными углами было количественно определено и нанесено на график в зависимости от угла на рисунке 7D. Результат указывает на отсутствие значительного процесса поляризации при стимуляции EGF в неподвижных клетках.

Усредненные результаты полярности для нескольких мигрирующих клеток были рассчитаны путем выравнивания их направления движения в сторону одного и того же угла.Через 52 минуты после EGF нормализованное количество пикселей с высокой активностью RhoA в каждом угловом клине четко отображало поляризованный узор, при этом большее количество пикселей накапливалось в задней части мигрирующих клеток (рис. 8A). Напротив, распределение областей с более высокой активностью RhoA оказалось более случайным в стационарных клетках (фиг. 8B). Все эти результаты предполагают, что поляризация активности RhoA в клетках HeLa играет важную роль в регулировании миграции клеток и ее направлений.

Рисунок 8.Сравнение субклеточного распределения активности RhoA между неподвижными и мигрирующими клетками после стимуляции EGF.

Нормализованное количество пикселей с высоким FRET в каждом клине нанесено на график в зависимости от угла клина для множественных (A) мигрирующих и (B) неподвижных клеток через 52 минуты после стимуляции EGF. Планки погрешностей представляют собой значения стандартной ошибки. Мигрирующие клетки вращали и выравнивали так, чтобы они имели одинаковое направление миграции. Передняя и задняя стороны направления миграции определялись относительным расположением клиньев по отношению к их соответствующим центроидам.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g008

Обсуждение

Недавнее развитие технологий визуализации живых клеток предоставило множество мощных инструментов и позволило собрать огромное количество данных изображения / фильмов, что требует значительных затрат времени и усилий на анализ и количественную оценку изображений. Однако отсутствуют удобные для пользователя и автоматизированные инструменты анализа изображений с высокой пропускной способностью. Мы разработали алгоритмы и методы анализа изображений, основанные на регистрации изображений, для отслеживания сложного движения мигрирующих клеток.Эти методы применялись для автоматического отслеживания и количественной оценки замедленного соотношения FRET биосенсора Raichu-RhoA в субклеточных областях в живых клетках HeLa, а также для анализа полярности внутриклеточных областей с высокой активностью RhoA. Результаты предполагают, что субклеточное распределение высокой активности RhoA по-разному регулируется в мигрирующих и неподвижных клетках. Эти методы также могут применяться для анализа общих флуоресцентных изображений сигнальной трансдукции в живых клетках и обеспечения автоматизированной, эффективной и объективной количественной оценки большого количества данных визуализации.

Представленные в статье методы анализа изображений полностью автоматизированы. Поскольку ROI автоматически отслеживались в движущихся ячейках, пользователям нужно только определить начальные интересующие области на первом изображении ячейки. Для каждого кадра с четырьмя областями интереса требуется несколько секунд для количественной оценки отношения FRET с помощью персонального компьютера. Автоматизация этого вида анализа имеет решающее значение, потому что на текущем этапе большая часть анализа данных для визуализации FRET в живых клетках выполнялась вручную с контурами ROI, перемещаемыми биологом, если клетка перемещается или меняет форму.Это ручное отслеживание ROI для живых клеток может привести к низкой эффективности, утомительности и неточности. При использовании нашего метода анализа отслеживание в целом очень надежно, если области интереса были выбраны внутри тела ячейки и вдали от края ячейки. Поскольку выпуклая оболочка или контур ячейки, но не фактический край ячейки, были сопоставлены с единичным диском, этот метод стал бы менее точным, если бы область интереса была близка к некоторым краям ячейки, которые меняют свою форму с вогнутой на выпуклую. Дальнейшее совершенствование метода автоматического отслеживания потребует разработки и реализации более сложного алгоритма регистрации изображений.Тем не менее преобразование различных ячеек в единую схему, такую ​​как единичный диск, должно быть полезным и важным для стандартизации и сравнения сигналов от каждой отдельной ячейки.

Применение нового метода кластерного анализа полезно для анализа и количественной оценки субклеточного распределения и полярности активности RhoA. Абсолютное значение активности RhoA не представляло очевидной картины полярности. Однако наблюдалось значительное увеличение количества пикселей с относительно более высокой активностью RhoA в хвосте мигрирующих клеток после стимуляции EGF, о чем свидетельствует количественная оценка с использованием автоматического кластерного анализа (фигура 6D).Это высококоординированное распределение активности RhoA в космосе, вероятно, может вносить вклад и контролировать направление миграции клеток. Концентрированное накопление высокой активности RhoA в задней части клетки может помочь отделению клеточного хвоста от субстрата во время миграции [41], возможно, за счет активации расположенной ниже молекулы ROCK, которая контролирует фосфорилирование киназы легкой цепи миозина (MLCK) и фосфатазы ( MLCP) для регуляции сократимости актомиозина [5]. Ингибированная активность RhoA в направлении миграции клеток может приводить к активации Rac1 [42], небольшой GTPase, контролирующей выпячивание клеток и образование ламеллиподий [43].Таким образом, клетки могут скоординированно перемещаться в направлении, противоположном полярности RhoA.

Сравнение результатов для мигрирующих и неподвижных клеток выявило различные пространственные паттерны активности RhoA в этих двух типах клеток. В отличие от поляризованной активности RhoA в мигрирующих клетках, глобальное подавление активности RhoA в неподвижных клетках при стимуляции EGF может способствовать выпячиванию во всех направлениях без дискриминации, что предотвращает постоянную и направленную миграцию.Глобальное изменение активности RhoA при стимуляции EGF в мигрирующих клетках оказалось менее значительным по сравнению с таковым в стационарных клетках. Это в значительной степени связано с постоянным поддержанием высокой активности RhoA на заднем крае мигрирующих клеток, но не в стационарных клетках. Дальнейшие исследования необходимы для выяснения детального молекулярного механизма, управляющего дифференциальными ответами RhoA стационарных и мигрирующих клеток.

Таким образом, наш метод анализа изображений может позволить использовать высокопроизводительные и автоматизированные средства для количественной оценки и анализа пространственно-временных молекулярных сигналов в живых клетках.Это особенно эффективно при анализе большого количества сигналов от ячеек с изменяющейся формой, например мигрирующие клетки. Мы также продемонстрировали важность этого метода, применив его для количественной оценки динамической активности RhoA на субклеточных уровнях в мигрирующих и неподвижных клетках HeLa. Результаты показали, что EGF индуцирует подавление RhoA как в мигрирующих, так и в неподвижных клетках HeLa. Однако поляризованное распределение активности RhoA может постоянно наблюдаться только в мигрирующих, но не в неподвижных клетках.

Дополнительная информация

Фильм S1.

Образы FRET были сопоставлены с диском. Пространственно-временная динамика отношения FRET, представляющего активность RhoA при стимуляции EGF, показана в типичной мигрирующей клетке (слева) и эталонных изображениях, нанесенных на диск (справа). Красный и синий цвета указывают на высокую и низкую активность RhoA соответственно. Было показано, что ячейка перемещается в поле обзора, особенно во время более поздней части видео (слева), в то время как эталонные изображения ячейки оставались в пределах статического единичного диска (справа).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.s001

(9,81 МБ MOV)

Фильм S3.

Геометрические особенности шести кластеров (справа) и трех верхних кластеров (слева) в мигрирующей ячейке показаны во времени. Эти регионы имеют цветовую кодировку в соответствии с их активностями RhoA, причем холодные и горячие цвета представляют регионы с низким и высоким уровнями активности RhoA соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.s003

(10,26 МБ MOV)

Благодарности

Мы благодарим Dr.Мичиюки Мацуда за драгоценные реактивы и конструкции.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: JPE SL YW. Проведены эксперименты: JX. Проанализированы данные: JPE SL YW. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: JPE SL. Написал статью: JPE SL YW.

Список литературы

1. 1. Ридли А.Дж., Шварц М.А., Берридж К., Фиртель Р.А., Гинзберг М.Х. и др. (2003) Миграция клеток: интеграция сигналов спереди назад. Science 302: 1704–1709.
2. 2. Jaffe AB, Hall A (2005) Rho GTPases: биохимия и биология. Annu Rev Cell Dev Biol 21: 247–269.
3. 3. Raftopoulou M, Hall A (2004) Миграция клеток: лидируют Rho GTPases. Дев Биол 265: 23–32.
4. 4. Уилер А.П., Ридли А.Дж. (2004) Почему три белка Rho? RhoA, RhoB, RhoC и подвижность клеток. Exp Cell Res 301: 43–49.
5. 5. Риенто К., Ридли А.Дж. (2003) Камни: многофункциональные киназы в поведении клеток.Nat Rev Mol Cell Biol 4: 446–456.
6. 6. Чжан Дж., Кэмпбелл Р. Э., Тинг А. Ю., Цзян Р. Ю. (2002) Создание новых флуоресцентных зондов для клеточной биологии. Nat Rev Mol Cell Biol 3: 906–918.
7. 7. Pertz O, Hodgson L, Klemke RL, Hahn KM (2006) Пространственно-временная динамика активности RhoA в мигрирующих клетках. Природа 440: 1069–1072.
8. 8. Курокава К., Мацуда М. (2005) Локальная активация RhoA как требование для индукции взъерошивания мембраны. Mol Biol Cell 16: 4294–4303.
9. 9. Цзянь Р.Ю. (1998) Зеленый флуоресцентный белок. Анну Рев Биохим 67: 509–544.
10. 10. Ван И, Шайи Джи-Дж, Чиен С. (2008) Флуоресцентные белки, визуализация живых клеток и механобиология: видеть — значит верить. Annu Rev Biomed Eng 10: In Press.
11. 11. Palmer AE, Jin C, Reed JC, Tsien RY (2004) Bcl-2-опосредованные изменения в Ca2 + эндоплазматического ретикулума проанализированы с помощью улучшенного генетически кодируемого флуоресцентного сенсора. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 17404–17409.
12. 12. Йошизаки Х., Охба Й., Курокава К., Ито Р. Э., Накамура Т. и др. (2003) Активность ГТФаз семейства Rho во время деления клеток, визуализированная с помощью зондов на основе FRET. J Cell Biol 162: 223–232.
13. 13. Йошизаки Х., Охба Й., Паррини М.К., Дульянинова Н.Г., Бресник А.Р. и др. (2004) Тип-специфическая регуляция активности RhoA во время цитокинеза. J Biol Chem 279: 44756–44762.
14. 14. Nakamura T, Aoki K, Matsuda M (2005) Визуализация FRET в конусах роста нервов выявляет высокий уровень активности RhoA в периферическом домене.Brain Res. Mol. Brain Res. 139: 277–287.
15. 15. Ямана Н., Аракава Ю., Нишино Т., Курокава К., Танджи М. и др. (2006) Путь Rho-mDia1 регулирует клеточную полярность и оборот фокальной адгезии в мигрирующих клетках посредством мобилизации Apc и c-Src. Mol Cell Biol 26: 6844–6858.
16. 16. Эль-Сибай М., Перц О, Панг Х., Ип С.К., Лоренц М. и др. (2008) RhoA / ROCK-опосредованное переключение между Cdc42- и Rac1-зависимым выпячиванием в клетках карциномы MTLn3. Exp Cell Res 314: 1540–1552.
17. 17. Wong K, Pertz O, Hahn K, Bourne H (2006) Поляризация нейтрофилов: пространственно-временная динамика активности RhoA поддерживает механизм самоорганизации. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 3639–3644.
18. 18. Ван И, Шайи Джи-Дж, Чиен С. (2008) Флуоресцентные белки, визуализация живых клеток и механобиология: видеть — значит верить. Ежегодный обзор биомедицинской инженерии 10: 1–38.
19. 19. Зитова Б., Флюссер Дж. (2003) Методы регистрации изображений: обзор.Image and Vision Computing 21: 977–1000.
20. 20. Jagalur M, Pal C, Learned-Miller E, Zoeller RT, Kulp D (2007) Анализ экспрессии генов in situ в мозге мыши с регистрацией изображений, выделением признаков и кластеризацией блоков. BMC Bioinformatics 8: Приложение 10S5.
21. 21. Чемберлен CE, Крайнов В.С., Хан К.М. (2000) Визуализация пространственно-временной динамики активации Rac in vivo с помощью FLAIR. Методы Enzymol 325: 389–400.
22. 22. Hodgson L, Nalbant P, Shen F, Hahn K (2006) Визуализация и коррекция фотообесцвечивания Mero-CBD, датчика эндогенной активации Cdc42.Методы Enzymol 406: 140–156.
23. 23. Шен Ф., Ходжсон Л., Рабинович А., Перц О, Хан К. и др. (2006) Функциональная протеометрия миграции клеток. Цитометрия A 69: 563–572.
24. 24. Rieger B, Molenaar C, Dirks RW, Van Vliet LJ (2004) Выравнивание ядра клетки от меченых белков только для 4D визуализации in vivo. Microsc Res Tech 64: 142–150.
25. 25. Матула П., Матула П., Козубек М., Дворжак В. (2006) Быстрое точечное трехмерное выравнивание живых клеток.IEEE Trans Image Process 15: 2388–2396.
26. 26. Dormann D, Libotte T, Weijer CJ, Bretschneider T (2002) Одновременная количественная оценка подвижности клеток и ассоциации белка с мембраной с использованием активных контуров. Цитоскелет клеточного мотила 52: 221–230.
27. 27. Dubin-Thaler BJ, Giannone G, Dobereiner HG, Sheetz MP (2004) Нанометрический анализ распространения клеток на покрытых матриксом поверхностях выявляет два различных состояния клеток и ШАГИ. Biophys J 86: 1794–1806.
28. 28.Mott RE, Helmke BP (2007) Картирование динамики структурных изменений эндотелиальных клеток, вызванных напряжением сдвига. Am J Physiol Cell Physiol 293: C1616–1626.
29. 29. Shi LZ, Nascimento JM, Berns MW, Botvinick EL (2006) Компьютерное отслеживание одной спермы. Дж. Биомед Опт 11: 054009.
30. 30. Shi LZ, Nascimento JM, Chandsawangbhuwana C, Botvinick EL, Berns MW (2008) Автоматическая система для изучения подвижности и энергетики сперматозоидов. Биомедицинские микроустройства 10: 573–583.
31. 31. Wischgoll T, Choy JS, Ritman EL, Kassab GS (2008) Валидация метода на основе изображений для извлечения морфометрии коронарных артерий. Энн Биомед Eng 36: 356–368.
32. 32. Гоштасби А. (1986) Кусочно-линейные функции отображения для совмещения изображений. Распознавание образов 19: 459–466.
33. 33. Оцу Н. (1979) Метод выбора порога по гистограммам уровней серого. IEEE Transactions по системам, человеку и кибернетике 9: 62–66.
34. 34.Barber CB, Dobkin DP, Huhdanpaa H (1996) Алгоритм quickhull для выпуклых оболочек. Транзакции ACM на математическом программном обеспечении 22: 469–483.
35. 35. Джордж П.Л. (1991) Автоматическое создание сетки: применение к методам конечных элементов. Нью-Йорк: Вили.
36. 36. Ли Дж., Исихара А., Териот Дж., Джейкобсон К. (1993) Принципы передвижения для клеток простой формы. Природа 362: 167–171.
37. 37. Спат Х. (1985) Рассмотрение и анализ кластеров: теория, программы FORTRAN, примеры.Гольдшмидт Дж., Переводчик, редактор. Нью-Йорк: Halsted Press ..
38. 38. Seber GAF (1984) Многомерные наблюдения. Барнетт В., Брэдли Р.А., Хантер Дж. С., Кендалл Д. Г., Миллер Р. Дж. Мл. И др., Редакторы. Нью-Йорк: Wiley ..
39. 39. Vielkind S, Gallagher-Gambarelli M, Gomez M, Hinton HJ, Cantrell DA (2005) Регулирование интегрина с помощью RhoA в тимоцитах. J Immunol 175: 350–357.
40. 40. Salmon WC, Adams MC, Waterman-Storer CM (2002) Двухволновая флуоресцентная спекл-микроскопия выявляет связь микротрубочек и движений актина в мигрирующих клетках.J Cell Biol 158: 31–37.
41. 41. Лауффенбургер Д.А., Хорвиц А.Ф. (1996) Миграция клеток: физически интегрированный молекулярный процесс. Ячейка 84: 359–369.
42. 42. Родригес О.К., Шефер А.В., Mandato CA, Forscher P, Bement WM и др. (2003) Консервативные взаимодействия микротрубочек с актином в движении и морфогенезе клеток. Nat Cell Biol 5: 599–609.
43. 43. Холл A (2005) Rho GTPases и контроль клеточного поведения. Biochem Soc Trans 33: 891–895.

Глубина резкости — журнал UMBC

Том Мур

Закройте глаза и представьте, если хотите, что-нибудь научное. Возможно, ваш разум вызывает в воображении образ освоения космоса, или тающий ледник, затронутый изменением климата, или глаза комара, увеличенные в электронный микроскоп. Что бы вы ни представляли, на это почти наверняка повлияла сфера фотографии, которая с момента своего изобретения в начале 1800-х годов обратила свой взор на мир вокруг нас, позволяя нам видеть, делиться и интерпретировать наше окружение по-новому.

Пересечение фотографии и науки давно интересовало UMBC, старшего научного сотрудника Марвина Хейфермана . «Я был очарован научной фотографией в течение многих лет — снимки микробов, слишком маленьких для того, чтобы их можно было обнаружить человеческим глазом, звезд или галактик, слишком далеких, чтобы их можно было непосредственно увидеть, и процессов, которые происходят слишком быстро или медленно, чтобы их можно было легко заметить, » он говорит.

В 2016 году Хейферман организовал многолетний проект Seeing Science, финансируемый Управлением исследований и Центром искусства, дизайна и визуальной культуры. Он привлек преподавателей, студентов и выпускников из разных дисциплин (к которым присоединились другие выдающиеся ученые по всей стране), чтобы изучить, как мы видим науку, через серию публичных и онлайн-мероприятий, кинопоказов, выставок и веб-сайтов, призванных стимулировать междисциплинарный подход. диалог.

Кульминацией работы Хейфермана стала книга Видя науку: как фотография открывает Вселенную , выпущенная этой весной в рамках партнерства между UMBC и Aperture, некоммерческим фондом и издателем, занимающимся развитием фотографии. Этот красивый том, наполненный изображениями с момента зарождения фотографии до наших дней, содержит десятки эссе по различным темам — от распознавания лиц до открытия рентгеновских лучей и научной фантастики и т. Д. — и, конечно же, сотни фотографий.

Астронавт в отставке Скотт Келли , который посещал UMBC в 1980-х годах, предоставил предисловие к книге, в котором он описывает свой год на Международной космической станции, делая фотографии космоса, географии Земли, снежных бурь и городов, освещенных светом. ночь.

Два преподавателя UMBC написали эссе для Видя науку : Марк Элис Дюрант , профессор изобразительных искусств, пишет о «Чуде очевидности», прослеживая танец между знанием и чудом, документацией и удивлением, фактом и вымыслом; и Джозеф Татаревич , доцент кафедры истории и директор программы человеческого контекста науки и технологий, написал «Научную фантастику и движущиеся изображения», исследуя фильм времен знаменитого Жоржа Мельеса «Путешествие на луну » ( Путешествие на Луну , 1902) к книге Уолта Диснея Человек в космосе (1955).

Ребекка Адельман , доцент кафедры медиа и коммуникационных исследований, участвовала в нескольких онлайн-обсуждениях, и ее взгляды на изображения можно найти в книге. Хейферман также исследует фотографии Линн Казабон, , профессора изобразительного искусства, и Мелиссы Пенли Кормье, магистра медицины. ’17, изобразительное искусство , программный специалист в области изобразительного искусства.

«Специализированные изображения настолько прочно вошли в нашу повседневную жизнь, что мы забываем, насколько сильно они помогают нам понять окружающий мир», — делится Хейферман.«МРТ травмированного колена, сонограмма на дверце холодильника, технология распознавания лиц, позволяющая разблокировать смартфон — все это рутинные примеры того, как мы используем научную фотографию в качестве повседневного инструмента».

*****

Заголовок: Студийный процесс проекта Fret & Focus, год документирования тревог с помощью микроскопических слайдов, 2016. Рисунок Мелиссы Пенли Кормье.

На основе активности ратиометрического зонда FRET выявляются обусловленные онкогеном изменения в лабильных пулах меди, вызванные измененным метаболизмом глутатиона

Медь является необходимым окислительно-восстановительным питательным веществом для жизни (1), выступая в качестве мощного каталитического и / или структурного кофактора в белках для фундаментальные процессы, такие как транспорт кислорода, дыхание и метаболизм, рост и дифференцировка клеток, а также передача сигналов (2–6). В дополнение к прочно связанным пулам меди, скрытым в активных центрах металлопротеинов, новые данные свидетельствуют о наличии лабильных пулов меди, которые относительно слабо связаны низкомолекулярными лигандами (7).Лабильные пулы меди вносят вклад в растущее число динамических сигнальных путей переходных металлов (8), включая нейронную коммуникацию (9⇓ – 11), обоняние (12, 13), липолиз (6), циклы покоя-активности (14) и киназные пути. участвуют в передаче сигналов и онкогенезе (5, 15). Действительно, нарушение регуляции меди может привести к аберрантным явлениям окислительного и нитрозативного стресса, которые сопровождают заболевания, включая рак (5, 16), сердечно-сосудистые расстройства, нейродегенеративные болезни Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона (3, 17), диабет и ожирение, а также генетические болезни Менкеса и Вильсона. расстройства (18⇓⇓ – 21).

Дихотомия «сигнал / стресс» меди мотивирует разработку новых химических инструментов, помогающих расшифровать ее более широкий вклад в физиологию и патологию. В этом контексте флуоресцентные (6, 10, 11, 14, 22–38), биолюминесцентные (39) и магнитно-резонансные датчики (40–42) для визуализации лабильных медных пулов со специфичностью металла и степени окисления, особенно при использовании в сочетании с дополнительными методами измерения общего содержания металлов (22, 43, 44), включая масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой с лазерной абляцией (LA-ICP-MS) (45 – 47), наномасштабная вторичная ионная масс-спектрометрия (38, 48) и рентгеновская флуоресцентная микроскопия (10, 49, 50) могут обеспечить согласованную картину гомеостаза металлов для данной биологической модели.Таким образом, химическое ограничение в разработке флуоресцентных зондов состоит в том, что подавляющее большинство индикаторов меди на сегодняшний день реагируют только через изменения интенсивности флуоресценции в одном цвете, что может усложнить количественные измерения пулов меди и / или сравнение уровней меди в разных биологических образцов из-за возможных изменений в захвате зонда наряду с помехами, возникающими из-за независящих от меди явлений, таких как неоднородность толщины образца и интенсивности света (51, 52).Чтобы решить эту проблему, логометрические зонды, которые используют спектральные изменения возбуждения / излучения на 2 или более длинах волн, могут в принципе обеспечить внутреннюю самокалибровку для неоднородной нагрузки зонда и ограничить интерференцию между различными образцами (53⇓⇓⇓ – 57). Однако большинство ратиометрических флуоресцентных индикаторов меди, о которых сообщалось на сегодняшний день, в значительной степени ограничены отсутствием специфичности степени окисления и / или снижением общей интенсивности флуоресценции при обнаружении меди (31–37).

Теперь мы представляем разработку, синтез и биологические применения логометрического флуоресцентного индикатора меди первого поколения, зонда-1 с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET) (FCP-1).Этот сенсорный зонд на основе активности использует хемоселективное Cu (I) -зависимое окислительное расщепление C-O трис [(2-пиридил) метил] аминовой (ТРА) (28, 58, 59) единицы, связывающей единицы донора флуоресцеина и акцептора родамина. (Схема 1). Высокая металлоспецифичность и степень окисления FCP-1 для Cu (I), наряду с его двухцветным ратиометрическим ответом FRET, позволяет использовать его для мониторинга динамических изменений в лабильных пулах Cu (I) в живых клетках. Благодаря самокалибровке, обеспечиваемой логометрическим ответом, FCP-1 был способен надежно обнаруживать снижение эндогенных уровней лабильной Cu (I) в эмбриональных фибробластах мыши (MEF), лишенных высокоаффинного переносчика меди Ctr1 ( Ctr1). ^{— / —} ) относительно сородичей дикого типа.Дальнейшие эксперименты выявили колебания лабильных уровней Cu (I), но не общих уровней меди, в условиях окислительно-восстановительного стресса, вызванного генетическими изменениями путей биосинтеза глутатиона. Интересно, что дефицит лабильных пулов Cu (I) был обнаружен при введении онкогенных BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , связывающих лабильную дисрегуляцию меди с онкоген-зависимым окислительно-восстановительным статусом. Способность FCP-1 контролировать лабильные пулы Cu (I) с помощью логометрического ответа обеспечивает отправную точку для дальнейших исследований окислительно-восстановительного вклада в передачу сигналов переходных металлов.

Результаты и обсуждение

Дизайн, синтез и характеристика FCP-1.

Вдохновленный модельными биоинорганическими соединениями TPA, которые демонстрируют Cu (I) -зависимую химию окислительного расщепления (28, 58, 59), наша конструкция FCP-1 на схеме 1 соединяет донор флуоресцеина FRET и акцептор родамина FRET с медь-чувствительным TPA. компоновщик. Изменения в лабильных уровнях Cu (I) могут модулировать внутримолекулярную эффективность FRET и приводить к разной интенсивности флуоресценции донора и акцептора на 2 разных длинах волн, которые могут быть самокалиброваны ратиометрическим способом.При более низких уровнях Cu (I) зонд остается нетронутым с более высоким FRET и доминирующей эмиссией родамина, с более высокими уровнями Cu (I), ведущими к медьзависимому окислительному расщеплению линкера TPA и меньшему FRET и эмиссии с преобладанием флуоресцеина.

Синтез FCP-1 начинается с получения метилового эфира флуоресцеина, функционализированного 2-бромметилпиридином ( 2 ), и родамина, функционализированного пиколиламином ( 5 ; Схема 2). Соединение 2 было синтезировано в 2 стадии из ранее описанного метилового эфира флуоресцеина путем нуклеофильного замещения на 6- (бромметил) -2-пиридинметанол и последующего бромирования метилового спирта.Параллельно получали нозил-защищенный пиколиламин ( 3 ) путем монозамещения бис (хлорметил) пиридина из 4-нитро- N — (2-пиридинилметил) бензолсульфонамид и затем подвергали реакции с родамином, функционализированным пиперазинилом (Pz-родамином). позволить себе 4 . Затем с нозильной группы 4 снимают защиту тиофенолом и K ₂ CO ₃ с получением 5 . Имея в руках ключевые элементы 2 и 5 , мотив TPA может быть сгенерирован путем нуклеофильного замещения 2-бромметильной группы на 2 пиколиламином на 5 в основных условиях, что дает конечный ратиометрический зонд FCP-1 который был охарактеризован с помощью ЯМР ¹ H и ¹³ C { ¹ H}, МС высокого разрешения и МС с жидкостной хроматографией (ЖХ-МС; SI Приложение , рис.S1). Зонд на основе интенсивности Cu (I) FL-TPA был приготовлен в качестве контрольного соединения с тем же триггером восприятия на основе активности, зависящим от Cu (I), и флюоресцеиновым каркасом, но без ратиометрического ответа (схема 2).

Синтез FCP-1 и контрольного зонда FL-TPA.

Реакционная способность и селективность FCP-1 по отношению к меди.

Известно, что внутриклеточная среда восстанавливается и содержит высокие концентрации биомолекул, что приводит к скоплению макромолекул (60, 61).Таким образом, чтобы имитировать аспекты этих свойств in vitro, мы оценили FCP-1 в буфере PBS, содержащем глутатион (2 мМ) и полиэтиленгликоль (PEG) -400 (40%, об. / Об.). FCP-1 показал максимумы поглощения при 465, 493 и 552 нм с молярными коэффициентами экстинкции 20 000, 22 100 и 40 000 M ^-1 см ^-1 , соответственно ( SI Приложение , рис. S2). Первые 2 максимума поглощения соответствовали поглощению флуоресцеиновой составляющей, поскольку аналогичные максимумы поглощения при 460 и 489 нм были обнаружены в спектрах поглощения FL-TPA ( SI Приложение , рис.S2) и сообщил о моноклеточном метиловом эфире флуоресцеина (62, 63), тогда как самое низкое поглощение энергии при 552 нм происходило от части родамина ( SI Приложение , рис. S2). При фотовозбуждении при 458 нм было обнаружено, что FCP-1 испускает при 526 и 576 нм (фиг. 1 A ), что соответствует сигнатурам флуоресцеина и родамина, соответственно. Примечательно, что строительный блок Pz-родамин показывает только слабое поглощение при 458 нм ( SI Приложение , рис. S2). Вместе со значительным вкладом низкоэнергетической флуоресценции от возбуждения от 450 до 500 нм, что находится в области поглощения FL-TPA ( SI Приложение , рис.S3), данные подтверждают наличие FRET от донора флуоресцеина к акцептору родамина. При использовании FL-TPA в качестве эталонного соединения-донора FRET ( SI Приложение , рис. S4) с предположением, что тушение флуоресценции донора происходит только из процесса FRET, эффективность FRET в кассете FCP-1 оценивается в 84%. .

Фотофизические свойства и селективность Cu (I) FCP-1 в водных буферных растворах. ( A ) Изменения скорректированных спектров излучения FCP-1 (5 мкМ) в водном буферном растворе.( Вставка ) Изменение ратиометрического излучения FCP-1, F ₅₂₆ / F ₅₇₆ , с Cu (I) (10 мкМ) с течением времени. ( B ) Скорректированные спектры излучения FCP-1, измеренные при различных концентрациях. ( C ) Никаких значительных изменений в соотношении выбросов F ₅₂₆ / F ₅₇₆ при различных концентрациях FCP-1 не наблюдается. ( D ) Изменения в соотношении FCP-1 (5 мкМ) к различным биологически значимым ионам металлов, а также кобальт (II) -содержащему витамину B ₁₂ в F ₅₂₆ / F ₅₇₆ .Черные столбцы представляют собой логометрический отклик излучения, наблюдаемый при добавлении конкурирующих ионов металлов (1 мМ для Na ⁺ , K ⁺ , Mg ²⁺ и Ca ²⁺ и 10 мкМ для всех остальных d- блокируют ионы металлов, а также витамин B ₁₂ ) через 15 мин. Красные столбцы представляют собой логометрическую реакцию эмиссии при последующем добавлении 10 мкМ Cu (I) через 15 мин. Обозначения: 1, Na ⁺ ; 2, К ⁺ ; 3, Mg ²⁺ ; 4, Ca ²⁺ ; 5, Mn ²⁺ ; 6, Fe ²⁺ ; 7, 10 мкМ Co ²⁺ ; 8, 1 мкМ Co ²⁺ ; 9, витамин B ₁₂ ; 10, Ni ²⁺ ; 11, Cu ⁺ ; 12, Zn ²⁺ .( E ) Спектры излучения и ( F ) F ₅₂₆ / F ₅₇₆ коэффициент излучения (черный) FCP-1 (5 мкМ) или FCP-1 с добавлением (красный) Cu (II) (10 мкМ), (синий) Cu (II) (10 мкМ) + GSH (2 мМ) или (голубой) Cu (I) (10 мкМ) + GSH (2 мМ) через 15 мин. Все спектры снимали в водном буфере (PBS с 2 мМ GSH и 40 об.% PEG-400) с λ _ex = 458 нм.

При добавлении Cu (I) FCP-1 показал увеличение эмиссии флуоресцеина при 526 нм с течением времени с одновременным падением флуоресценции родамина при 576 нм (рис.1 А ). Анализ ЖХ-МС подтверждает образование фрагментов метилового эфира флуоресцеина ( P1 ) и родамина-TPA ( P2 ) при добавлении Cu (I) к раствору FCP-1 ( SI Приложение , Рис. S5) и аэробные условия требуются для запуска спектральных изменений эмиссии ( SI Приложение , рис. S6) в соответствии с Cu (I) -опосредованным окислительным расщеплением связи C-O бензилового эфира на линкере TPA FCP-1. Это расщепление C – O приводит к отделению донора флуоресцеина от акцептора родамина и, следовательно, приводит к снижению внутримолекулярной эффективности FRET с ратиометрическим изменением спектра излучения (рис.1 А ). Логометрическое изменение флуоресценции FCP-1 при 526 и 576 нм ( F ₅₂₆ / F ₅₇₆ ) было быстрым и достигало насыщения после ~ . 30 мин в присутствии 2-кратного избытка Cu (I) (10 мкМ). Примечательно, что соотношение FCP-1 F ₅₂₆ / F ₅₇₆ показало линейную реакцию доза-реакция с добавлением Cu (I) от 0,01 до 1 мкМ ( SI Приложение , рис. S7 A ). ), подчеркивая способность FCP-1 определять уровни Cu (I) в этом диапазоне по логометрическому изменению флуоресценции.FCP-1 показал высокую чувствительность к Cu (I), о чем свидетельствуют обнаруживаемые спектральные изменения излучения при 10 нМ Cu (I) ( SI Приложение , рис. S7 B ) и предел обнаружения 16,7 нМ на основе метод 3σ из 5 независимых экспериментов (64, 65). Что еще более интересно, базальный коэффициент эмиссии F ₅₂₆ / F ₅₇₆ FCP-1 не показал значительных изменений при различных концентрациях зонда (от 0,5 до 20 мкМ; Рис. .Эта внутренняя самокалибровка имеет преимущество, поскольку было обнаружено, что FCP-1 менее флуоресцирует при более высоких концентрациях, предположительно из-за самотушения, которое является общей проблемой, обнаруживаемой во флуорофорах ( SI Приложение , рис. S8) (66) . В самом деле, незначительные изменения в ратиометрической эмиссии FCP-1 указывают на то, что FRET происходит в основном по внутримолекулярному механизму, а независимая от концентрации ратиометрическая флуоресценция FCP-1 дополнительно подчеркивает его потенциал в сравнительной визуализации лабильных пулов Cu (I) в биологических образцах с помощью предотвращение возможных осложнений, возникающих из-за различий в захвате зонда, толщине образца и интенсивности света.

Логометрическое изменение флуоресценции FCP-1 было селективным в отношении Cu (I) по сравнению с другими биологически значимыми ионами металлов, за исключением свободного Co (II) при 10 мкМ, который незначительно изменял флуоресценцию FCP-1 (рис. 1 D ). Примечательно, что эта концентрация экзогенного Co (II) намного выше, чем физиологически релевантные уровни лабильного Co (II), поскольку известно, что этот ион металла прочно связан с белками. Действительно, FCP-1 не показал значительных изменений в ратиометрическом сигнале в присутствии 10 мкМ кобаламина (витамин B ₁₂ ) (67), который является преобладающей формой Co (II) в системах млекопитающих, что позволяет предположить, что вмешательство в обнаружение содержания Cu (I) с помощью FCP-1 из Co (II) в биологических образцах должно быть незначительным.Конкурентные эксперименты также показали способность FCP-1 обнаруживать Cu (I) в растворах, содержащих другие биологически релевантные ионы металлов (рис. 1 D ). В дополнение к проявлению селективности по металлу, ратиометрический отклик FCP-1 зависит от степени окисления для Cu (I), поскольку зонд не реагирует ратиометрически на Cu (II) (рис. 1 E и F ). В качестве дополнительной поддержки этой селективности по степени окисления совместимость FCP-1 с Cu (II) и избытком глутатиона, который легко восстанавливает Cu (II) до Cu (I), приводит к спектрам излучения и F ₅₂₆ / Соотношение F ₅₇₆ , которое идентично полученному при обработке FCP-1 Cu (I) и избытком глутатиона (рис.1 E и F ). Эта специфичность состояния окисления важна для приложений FCP-1 при визуализации динамических изменений внутриклеточных лабильных пулов Cu (I) в условиях окислительно-восстановительного стресса и онкогенной трансформации, которые мы опишем позже.

Наконец, FCP-1 не реагирует на Ag (I), который является близким аналогом Cu (I), но не обладает мощной кислородно-зависимой окислительно-восстановительной активностью ( SI Приложение , рис. S9). Ввиду низкой растворимости Ag (I) в присутствии хлорид-и других галогенид-ионов, буферный раствор NaH ₂ PO ₄ (50 мМ, pH 7.4) вместо раствора PBS в этих сериях экспериментов. Действительно, в присутствии Ag (I) не наблюдалось значительного изменения соотношения F ₅₂₆ / F ₅₇₆ F, тогда как Cu (I) вызвала увеличение патента F ₅₂₆ / F. ₅₇₆ соотношение FCP-1 в том же буферном растворе ( SI Приложение , рис. S9). Эти данные предполагают, что наблюдаемые ратиометрические изменения флуоресценции FCP-1 при добавлении Cu (I) объясняются окислительно-восстановительной активностью Cu (I).Кроме того, было обнаружено, что присутствие восстанавливающих агентов имеет решающее значение для запуска логометрических изменений флуоресценции FCP-1, опосредованных Cu (I) ( SI Приложение , рис. S10), и действительно, аналогичные изменения флуоресценции наблюдались также при использовании аскорбата. вместо 2 мМ глутатиона (GSH) в качестве восстановителя ( SI Приложение , рис. S11). Наряду с наблюдаемым увеличением уровней GSSG (окисленной формы GSH) с сопутствующим падением уровней GSH (восстановленной формы) при добавлении Cu (I) к смеси растворов FCP-1 и GSH ( SI Приложение , стр. Инжир.S5 A ), эти данные подтверждают роль восстановителей в «рециркуляции» редокс-активных частиц Cu (I) для связывания с рецептором TPA и запуска последующего основанного на активности расщепления связи C-O бензилового эфира на компоновщик. Это расщепление связи происходит в основном по окислительному механизму, поскольку при добавлении Cu (I) в анаэробных условиях не наблюдается значительных изменений спектра излучения ( SI Приложение , рис. S6). Образование метилового эфира флуоресцеина и фрагментов родамин-TPA ( SI Приложение , рис.S5) приводит к снижению внутримолекулярной эффективности FRET и увеличению отношения F ₅₂₆ / F ₅₇₆ .

FCP-1 может отображать лабильные пулы Cu (I) в живых клетках.

Учитывая избирательную и чувствительную реакцию FCP-1 на металл и состояние окисления на Cu (I), мы попытались применить этот зонд для логометрической флуоресцентной визуализации лабильных пулов Cu (I) в живых клетках. С этой целью клетки HEK 293T подвергали воздействию различных доз CuCl ₂ (от 25 до 300 мкМ), тщательно промывали для удаления избытка меди из среды, а затем инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в течение 45 минут и визуализировали. .Клетки, дополненные медью, показали статистически значимое, дозозависимое увеличение соотношения F _{зеленый} / F _{оранжевый} по сравнению с контрольными клетками носителя (фиг. 2 B ). Напротив, медь-дефицитные клетки HEK 293T, полученные обработкой непроницаемым для мембран хелатором меди, батокупроинсульфонатом (BCS; 100 мкМ), промытые и впоследствии инкубированные с FCP-1 (5 мкМ), показали статистически значимое снижение F _{зеленый} / F _{оранжевый} Соотношение по сравнению с контрольными клетками (рис.2 C и D ). Наблюдаемое увеличение и уменьшение лабильных уровней Cu (I) при добавлении меди (CuCl ₂ ) и обеднении меди (BCS), соответственно, согласно измерениям с помощью визуализации FCP-1, были подтверждены дополнительными измерениями общих уровней меди с помощью ICP-MS. демонстрируя ожидаемые увеличения и уменьшения общего пула меди (рис. 2 E ). Контрольные эксперименты показали, что клетки оставались жизнеспособными, на что указывало ядерное окрашивание ( SI Приложение , фиг.S12 и S13). Эти данные устанавливают, что FCP-1 способен визуализировать как увеличение, так и уменьшение лабильных пулов Cu (I) в живых клетках с помощью логометрического считывания флуоресценции.

Ратиометрическая флуоресцентная визуализация лабильных уровней Cu (I) в живых клетках с использованием FCP-1. ( A ) Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HEK 293T, предварительно обработанных контрольным растворителем-носителем или различными концентрациями CuCl ₂ в полной среде в течение 18 часов. Затем клетки промывали PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 минут, а затем отображали.( B ) Средние коэффициенты излучения клеток, представленные как F _{зеленый} / F _{оранжевый} , как определено из экспериментов по визуализации в A , выполненных в трех экземплярах. ( C ) Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HEK 293T, предварительно обработанных контрольным растворителем-носителем или BCS (100 мкМ) в полной среде в течение 18 часов. Затем клетки промывали PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 минут, а затем отображали. ( D ) Средние коэффициенты излучения клеток FCP-1, F _{зеленый} / F _{оранжевый} , как определено в экспериментах в C , проведенных в трех повторностях. A и C отображаются в псевдоцвете и относятся к базовому контролю для этого эксперимента и независимо друг от друга. λ _ex = 458 нм. ( E ) Измерение ICP-MS для определения общих клеточных уровней ⁶³ Cu в клетках HEK 293T при добавлении и истощении меди относительно контроля (с нормализацией различных количеств клеток по общему клеточному уровню ³¹ P). Планки погрешностей обозначают стандартное вычисление (SD; n = 3).* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001 и ***** P <0,00001.

FCP-1 может отслеживать различия в уровнях лабильного Cu (I) в генетической клеточной модели неправильной регуляции меди.

Установив, что FCP-1 чувствителен к эндогенным пулам лабильной Cu (I) в базовых условиях и может реагировать на изменения лабильных пулов Cu (I) при фармакологическом добавлении и / или истощении меди, мы попытались изучить применение FCP-1 для визуализации изменений в эндогенных лабильных пулах Cu (I) посредством генетических манипуляций.С этой целью мы выполнили сравнительную визуализацию FCP-1 в клетках эмбриональных фибробластов мыши, которые являются либо Cu-избыточными ( Ctr1 ^{+ / +} MEF), либо Cu-дефицитными ( Ctr1 ^{— / —} MEFs) через нокаут высокоаффинного переносчика меди CTR1 (68⇓ – 70). Как и ожидалось, Ctr1 ^{+ / +} MEF, инкубированные с FCP-1, показали более высокие отношения F _{зеленый} / F _{оранжевый} по сравнению с Ctr1 ^{— / —} MEF. ( P <0.01; 3 A и B ), что указывает на то, что FCP-1 может точно определять относительное снижение эндогенных уровней лабильной Cu (I) в клетках, дефицитных по поглощению меди.

FCP-1 позволяет проводить сравнительную визуализацию уровней лабильных Cu (I) в живых клетках с измененными уровнями экспрессии высокоаффинного белка захвата меди CTR1. ( A ) Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии Ctr1 ^{+ / +} MEF и Ctr1 ^{— / —} MEF, обработанных контролем растворителя, CuCl ₂ (100 или 300 мкМ), или BCS (500 мкМ) в полной среде в течение 8 ч, промывали полной средой и PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 мин, а затем отображали с λ _ex = 458 нм.( B ) Средние коэффициенты излучения клеток FCP-1, F _{зеленый} / F _{оранжевый} , как определено из экспериментов, проведенных в трех повторностях. ( C ) Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии Ctr1 ^{+ / +} MEF и Ctr1 ^{— / —} MEF, инкубированных с FL-TPA (5 мкМ) в DPBS в течение 45 мин. Затем клетки получали изображение с λ _ex = 488 нм. ( D ) Средняя интенсивность клеточной флуоресценции FL-TPA, F _FL-TPA , определенная из экспериментов, проведенных в трех повторностях с λ _ex = 488 нм.Планки погрешностей обозначают SD ( n = 3). * P <0,05, ** P <0,01 и **** P <0,0001.

Для дальнейшей проверки способности FCP-1 контролировать дифференциальные уровни лабильного Cu (I) в клетках, Ctr1 ^{+ / +} MEF, инкубированные с различными концентрациями CuCl ₂ , показали дозозависимое увеличение в FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} соотношение. Напротив, никаких статистически значимых изменений в соотношениях F _{зеленый} / F _{оранжевый} не наблюдалось в Ctr1 ^{— / —} MEF, инкубированных с CuCl ₂ и затем визуализированных с помощью FCP-1 ( Инжир.3 A и B ). Тем временем жизнеспособность клеток поддерживалась, что подтверждено ядерным красителем DRAQ5 ( SI, приложение , фиг. S14 и S15). Разница в ответе ратиометрической флуоресценции FCP-1 на добавление экзогенной меди между MEF дикого типа и MEF с нокаутом Ctr1 согласуется с неэффективным поглощением меди, а не с изменениями в оттоке меди при обработке Ctr1 ^{— / —} МЭФ с мембранно-непроницаемым хелатором меди BCS привели к снижению отношения F _{зеленый} / F _{оранжевый} , аналогично тому, что наблюдается в Ctr1 ^{+ / +} MEF (рис.3 A и B ). Дополнительные измерения ICP-MS подтверждают, что общие базальные уровни меди в MEF Ctr1 ^{— / —} ниже, чем Ctr1 ^{+ / +} MEF ( SI Приложение , рис. S16). Важно отметить, что логометрический ответ FCP-1 является ключом к его способности различать базальный и пониженный уровни лабильной Cu (I). Действительно, контрольный зонд FL-TPA, который демонстрирует флуоресцентный ответ «включается» без ратиометрической самокалибровки, не смог различить различия в базальных лабильных уровнях Cu (I) в Ctr1 ^{+ / +} MEF. и Ctr1 ^{— / —} MEF (рис.3 C и D ), при этом обнаруживая изменения в лабильной меди с добавлением экзогенной меди ( SI Приложение , рис. S17). Этот результат может быть объяснен потенциальными различиями в загрузке зонда в 2 клеточные линии MEF, что дополнительно подчеркивает самокалибрующуюся природу ратиометрического зонда FCP-1 как критическую особенность для точного определения уровней аналита в различных, изменчивых биологических образцах. Наконец, мы проверили, может ли FCP-1 нарушить лабильные пулы Cu, измеряя уровни белка CCS в MEF, обработанных FCP-1 или BCS, последний в качестве положительного контроля для снижения клеточного содержания Cu и повышения стабильности белка CCS.Действительно, уровни белка CCS не изменились в клетках, обработанных концентрацией FCP-1, достаточной для визуализации клеточных лабильных пулов Cu, в то время как обработка BCS увеличивала CCS, как и ожидалось ( SI Приложение , рис. S18), подтверждая, что FCP-1, сам по себе не изменяет клеточные уровни Cu в этих условиях. Данные демонстрируют, что FCP-1 может контролировать базальные уровни эндогенно лабильного Cu (I) и истощение таких пулов в ответ на снижение клеточного поглощения меди с помощью генетических или фармакологических средств.

FCP-1 определяет динамическое изменение лабильного Cu (I) по сравнению с общим пулом меди в живых клетках при окислительно-восстановительном стрессе.

Принимая во внимание специфичность степени окисления FCP-1 по отношению к Cu (I), мы исследовали влияние окислительно-восстановительного статуса клеток на лабильные пулы Cu (I), которое остается недостаточно изученным. Во-первых, мы подтвердили способность FCP-1 обнаруживать изменения в уровнях лабильного Cu (I) в клетках HeLa с помощью CuCl ₂ и лечения BCS (рис. 4 A ). Затем мы наблюдали за эффектом добавления аскорбата, который является мощным восстановителем, на внутриклеточные лабильные пулы Cu (I).Интересно, что мы наблюдали статистически значимое увеличение соотношения FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} , что свидетельствует об увеличении лабильных уровней Cu (I) в клетках, обработанных аскорбатом, по сравнению с контрольными клетками (рис. 4 В ) (31). Поскольку сопутствующие измерения ICP-MS не показали изменений общего уровня меди в клетках, обработанных аскорбатом, по сравнению с контрольными носителями (рис. 4 C ), увеличение F _{зеленый} / F _{оранжевый} может быть объясняется повышением лабильных уровней Cu (I).Несколько потенциальных факторов могут способствовать этому наблюдению в ответ на этот экзогенный восстановитель, включая сдвиг в глобальном или локальном окислительно-восстановительном балансе Cu (I) / Cu (II), снижение клеточной или субклеточной способности буферизовать Cu (I) и / или перемещение / рекомпарментализация лабильных пулов Cu (I).

FCP-1 определяет изменения в лабильном уровне Cu (I), но не в общем уровне меди в живых клетках при окислительно-восстановительном стрессе. Изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HeLa, предварительно обработанных контрольным растворителем ( A ), CuCl ₂ (200 или 300 мкМ) или BCS (100 мкМ) в полной среде в течение 18 ч или контрольным растворителем ( B ), аскорбатом (1 мМ) или BSO (1 мМ) в полной среде в течение 4 часов.Затем клетки промывали PBS, инкубировали с FCP-1 (5 мкМ) в DPBS в течение 45 мин и отображали с λ _ex = 458 нм. Гистограммы показывают среднюю ратиометрическую эмиссию FCP-1 клеток, F _{зеленый} / F _{оранжевый} , определенную из экспериментов, проведенных в трех повторностях. ( C ) Общие клеточные уровни ⁶³ Cu определяли с помощью экспериментов ICP-MS (с нормализацией различных количеств клеток по общему клеточному уровню ³¹ P).Планки погрешностей обозначают SD ( n = 3). * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 и **** P <0,0001 и не показывают изменений ни при обработке аскорбатом, ни при обработке BSO.

Имея эти результаты в руках, мы затем попытались использовать FCP-1 для изучения потенциальных связей между поддержанием лабильных пулов Cu (I) и эндогенными центральными окислительно-восстановительными медиаторами в клетке. В этом контексте глутатион (GSH) является повсеместно встречающимся в природе антиоксидантом и ключевой небольшой молекулой для поддержания правильного окислительно-восстановительного статуса клетки (71).На стадии, определяющей скорость биосинтеза GSH, участвует глутамат-цистеинлигаза (GCL), которая может ингибироваться бутионин сульфоксимином (BSO) (72). Интересно, что мы наблюдали, что соотношение FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} было выше в обработанных BSO клетках HeLa по сравнению с контрольными клетками (рис. 4 B ), что указывает на увеличение лабильных клеток. Уровни Cu (I) при блокировании синтеза GSH. Более того, общие уровни внутриклеточной меди существенно не различались между клетками, предварительно обработанными BSO, и контрольными клетками, как показывает ICP-MS (рис.4 C ), показывая, что динамические изменения связаны с лабильным пулом Cu (I), а не с общим увеличением или уменьшением общего пула меди. В целом, мы предостерегаем от чрезмерной интерпретации этих данных как подтверждающих простую и прямую модель комплексообразования Cu (I) -глутатион, поскольку, хотя было обнаружено, что водные растворы FCP-1 и Cu (I) показывают более высокие значения F ₅₂₆ / F ₅₇₆ соотношения при более низких концентрациях GSH in vitro ( SI Приложение , рис. S19), переменные значения констант диссоциации и стехиометрия медь-лиганд, полученные в различных буферных условиях, предполагают более сложное взаимодействие между металлами и путями окислительно-восстановительного гомеостаза (7 , 22, 73).Действительно, GSH является не только восстанавливающим агентом, но также сообщалось о взаимодействии с металло-шаперонами, такими как ATOX1, или белками, буферизующими / поглощающими металлы, такими как металлотионеин, с образованием комплексов, которые могут прочно связывать медь (73–76). Следовательно, наблюдаемое повышение уровня лабильного Cu (I) в результате дефицита GSH может действовать через более сложные, косвенные механизмы, область, которая требует дальнейшего изучения.

Для дальнейшего изучения корреляций между лабильными пулами Cu (I) и измененным метаболизмом GSH мы подготовили для исследования 2 клеточные линии MEF, где одна линия демонстрирует более низкие уровни общего GSH за счет стабильного генетического нокдауна эндогенного Gclc (каталитическая субъединица фермент, ограничивающий скорость GCL в синтезе GSH), а другая линия демонстрирует более низкие уровни GSH и более низкое отношение восстановленного GSH к окисленному (GSH / GSSG) за счет нокдауна глутатионредуктазы ( Gsr ; НАДФН-зависимый фермент, который расщепляет дисульфидной связи на 2 окисленных молекулах GSH) (71, 77).Как и ожидалось, опосредованный короткой шпилькой РНК (shRNA) нокдаун эндогенного Gclc (фиг.5, A и B ) значительно снижал уровни общего GSH в той же степени, что и MEF, обработанные BSO, что сильно ингибирует ферментативную функцию GCLC. , по сравнению с нецелевым управлением скремблированием ( Scr ) MEF (рис. 5 C ). Важно отметить, что в этих клетках с нокдауном Gclc не наблюдается значительного изменения соотношения GSH / GSSG, несмотря на более низкие общие уровни GSH (рис.5 D ). Напротив, генетический нокдаун Gsr с помощью shRNA значительно снизил как общий уровень GSH, так и соотношение GSH / GSSG, тогда как обработка ингибитором GSR кармустином (бис-хлорэтилнитрозомочевина, BCNU) только значительно снизила соотношение GSH / GSSH (рис. C – F ), что указывает на колебания внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса в сторону более окислительной среды при отсутствии способности регенерировать GSH из GSSG.

FCP-1 показывает повышение или истощение пулов лабильных Cu (I), вызванное генетическими изменениями в общем глутатионе (GSH) или соотношении восстановленного / окисленного глутатиона (GSH / GSSG).( A ) Нормализованная экспрессия qPCR мРНК Gclc и ( B ) иммуноблот-определение GCLC или ACTIN в MEF, стабильно экспрессирующих ненаправленную контрольную shРНК ( Scr ) и Gclc shRNA. ( C и D ) Количественная оценка общего клеточного глутатиона (GSH, микромолярный) или отношения GSH к GSSG (GSH / GSSG) ± SEM для MEF, стабильно экспрессирующих Scr , Gclc shRNA, Gsr shRNA , или Scr , обработанные 1 мМ BSO или 0.1 мМ BCNU. Уровни GSH и GSH / GSSG определяли с использованием набора GSH / GSSG-Glo Assay, и результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета ( n ≥ 11). ( E ) экспрессия qPCR мРНК Gsr и ( F ) иммуноблот-определение GSR или ACTIN в MEF, стабильно экспрессирующих Scr и Gsr shRNA. ( G ) Типичные конфокальные флуоресцентные изображения MEF, стабильно экспрессирующих Scr , Gclc shRNA или Gsr shRNA, инкубированных с FCP-1.( H ) Количественная оценка нормированной средней флуоресценции FCP-1 ( F _{зеленый} / F _{оранжевый} ) ± SEM. Данные взяты из анализа 98 отдельных клеток. ( I ) Предложенная модель изменений ферментов биосинтеза глутатиона и окислительно-восстановительного стресса на биодоступность лабильных пулов Cu (I). ( J ) Общие уровни Cu (части на миллион, ppm), обнаруженные с помощью ICP-MS из MEF, стабильно экспрессирующих Scr , Gclc shRNA или Gsr shRNA на вес образца ± SEM ( n = 6) .Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим многократным сравнением Даннета. * P <0,05, ** P <0,01 и **** P <0,0001; нс, статистически не значимо.

После подтверждения успешной манипуляции либо уровнями GSH, либо соотношением GSH / GSSG, FCP-1 применяли для исследования относительных уровней лабильной Cu (I) в этой панели генетически определенных клеточных линий. Нокдаун клетки Gclc показали более высокое соотношение FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} по сравнению с клетками Scr , в то время как более низкое FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} соотношение наблюдали в Gsr нокдаун клетках по сравнению с контролем (рис.5 G и H ). Поскольку нокдаун Gclc ингибирует фермент, участвующий в определяющей скорости стадии биосинтеза GSH, и имитирует фармакологическое лечение BSO (рис. 4 B ), мы приписываем наблюдаемое увеличение F _{зеленый} / F _{оранжевый} отношение к снижению общего уровня GSH. Минимальное изменение соотношения GSH / GSSG в этой линии клеток с нокдауном Gclc предполагает, что общее окислительно-восстановительное состояние клетки не затронуто, и вместо этого указывает на снижение уровней лабильных систем Cu (I) -буферирования (рис.5 I ). Включены потенциальные аддукты GSH-металло-шаперон или GSH-металлотионеин, оба из которых могут влиять на слабосвязанные пулы Cu (I) по сравнению с прочно связанными. С другой стороны, клетки с нокдауном Gsr показали более низкое соотношение GSH / GSSG (рис. 5 D ), что отражает более общую окислительную внутриклеточную среду и может привести к сдвигу в динамическом балансе Cu (I / II ) пулов, что приводит к снижению уровней лабильных Cu (I) (рис. 5 I ). Хотя общие уровни GSH также снижаются в Gsr нокдаун клетках, что может в некоторой степени увеличивать биодоступность лабильного Cu (I), статистически значимое снижение соотношения FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} относительно контроля указывает на общий лабильный дефицит Cu (I) и предполагает, что окислительно-восстановительный вклад большего количества GSSG по сравнению с GSH является доминирующим фактором.Поскольку механизм определения активности FCP-1 основан на кислородзависимой окислительно-восстановительной реакции с Cu (I), мы провели дополнительную серию контрольных экспериментов, используя ранее описанный медный флуоресцентный датчик включения, Copper Fluor-4 (CF4). , который действует по прямому обратимому механизму, основанному на связывании Cu (I) (14). CF4 показал повышенную флуоресценцию в линиях клеток с нокаутом Gclc , но уменьшенную флуоресценцию в клетках с нокаутом Gsr , что хорошо согласуется с результатами, полученными с FCP-1 ( SI Приложение , рис.S20), обеспечивая дополнительную поддержку изменений в лабильных пулах Cu (I), вызванных изменениями в статусе GSH и GSH / GSSG. Наконец, в то время как лабильные пулы Cu (I) изменяются в MEF, в которых отсутствуют Gclc или Gsr , никаких изменений в общем содержании меди при измерении с помощью ICP-MS не наблюдалось (фиг. 5 J ). Эти эксперименты показывают, что лабильные пулы Cu (I) могут увеличиваться и / или истощаться глутатион-зависимым образом в зависимости как от общего уровня GSH, так и от окислительно-восстановительных соотношений GSH / GSSG.

Онкогенные мутации BRAF

Отметив растущие связи между сигнальными путями меди и киназы, участвующими в онкогенезе, мы затем попытались применить идентификацию перекрестного взаимодействия медь-глутатион к онкогенезу. Действительно, быстрое размножение, связанное с онкогенезом, требует, чтобы раковые клетки увеличивали энергетический метаболизм и запускали клеточные механизмы для ответа на онкогенный стресс, чтобы поддерживать неограниченный рост опухоли, выживаемость и терапевтическую резистентность.Например, многие солидные опухоли демонстрируют повышенную продукцию активных форм кислорода (АФК) в ответ на более высокие энергетические потребности и дисфункцию митохондрий. В результате это вызывает антиоксидантную программу по детоксикации от АФК и поддержанию более надежного окислительно-восстановительного баланса (78). Например, MEF, экспрессирующие условные онкогенные аллели KRAS ^G12D или BRAF ^V619E , демонстрируют пониженные уровни внутриклеточных ROS с сопутствующим увеличением экспрессии мРНК генов метаболизма глутатиона Gclc и Gclm (79).Более того, эктопическая экспрессия KRAS ^G12D увеличивает общий уровень GSH, но снижает соотношение GSH / GSSG. Однако остается недостаточно понятным, изменяют ли онкогенные мутации в BRAF или KRAS внутриклеточные пулы лабильной Cu (I), нарушая внутриклеточный окислительно-восстановительный баланс, особенно через глутатионовые пути.

Чтобы ответить на этот вопрос, иммортализованные MEF трансформировали с помощью BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , а уровни внутриклеточной лабильной Cu (I) оценивали с помощью ратиометрической визуализации FCP-1.Интересно, что мы наблюдали уменьшение средней ратиометрической флуоресценции клеток MEF, трансформированных как BRAF ^V600E , так и KRAS ^G12D , по данным FCP-1 F _{зеленый} / F _{оранжевый} соотношение по сравнению с контрольные конгенеры (рис.6 A и B ). Эти результаты были фенокопированы в экспериментах по визуализации живых клеток с использованием комплементарного зонда CF4, что позволяет предположить, что свободно связанные пулы внутриклеточной Cu (I) уменьшаются при онкогенной трансформации ( SI Приложение , рис.S21 A и B ). В соответствии с этим мы обнаружили, что стабильность белка CCS, который деградирует зависимым от Cu образом, повышается в клетках, стабильно экспрессирующих эти онкогены, или когда клетки обрабатывают хелатором Cu BCS в качестве положительного контроля, что свидетельствует об истощении лабильных внутриклеточных Cu бассейны (рис.6 C ). Чтобы определить, отразился ли наблюдаемый лабильный дефицит Cu (I), обнаруженный с помощью визуализации живых клеток FCP-1 и CF4, на изменениях общего клеточного уровня Cu, ИСП-МС выполняли для контроля, BRAF ^V600E — или KRAS ^{. G12D} -экспрессирующие MEF, и эти клетки показали неизменные уровни общей Cu (рис.6 D ), подтверждая, что выборочно изменяется лабильный пул Cu (I), а не общий пул Cu. Кроме того, уровни транскрипта Ctr1 как в клетках BRAF ^V600E , так и в клетках KRAS ^G12D остаются аналогичными контрольным клеткам, что позволяет предположить, что наблюдаемое снижение лабильных уровней Cu (I) не связано с изменениями в импорте Cu в клетки (рис. E ). Хотя уровни транскрипта Atp7a были незначительно ниже как в клетках BRAF ^V600E , так и в клетках KRAS ^G12D (рис.6 F ), эти изменения в экспрессии мРНК Atp7a могут отражать клетки, чувствительные к более низким уровням биодоступности Cu (I). В качестве альтернативной гипотезе дифференциальной экспрессии транспортеров Cu CTR1 и ATP7A для снижения уровней лабильного Cu (I) недавние исследования установили, что снижение уровней CTR1 или введение поверхностно доступных мутаций в MEK1, который функционирует ниже онкогенного BRAF ^V600E , как подход к нарушению связывания Cu уменьшал BRAF ^V600E -управляемую передачу сигналов и рост опухоли (5, 80).Таким образом, взаимодействие Cu-MEK1 / 2 необходимо для передачи сигналов и туморогенеза, управляемых BRAF ^V600E , а снижение лабильных уровней Cu в MEF, трансформированных BRAF ^V600E , потенциально может быть вызвано увеличением доставки Cu в MEK1 / 2 для поддержки гиперактивированных Передача сигналов митоген-активируемой протеинкиназы. Чтобы экспериментально рассмотреть эту возможность, BRAF ^V600E -трансформированные MEF были сконструированы для стабильной экспрессии скремблирующей shRNA или Mek1 shRNA с РНК-опосредованной интерференционной устойчивой MEK1 дикого типа или Cu-связывающего мутанта MEK1 (MEK1 ^CBM ). и ратиометрическую флуоресценцию от FCP-1 в этих клеточных линиях сравнивали с нетрансформированными MEF.В то время как экспрессия BRAF ^V600E снижала F _{зеленый} / F _{оранжевый} на ∼20%, снижение сохранялось в присутствии как MEK1 дикого типа, так и MEK1 ^CBM , что позволяет предположить, что наблюдаемое снижение лабильный пул Cu (I) не зависит от связывания MEK1 / 2 Cu ( SI, приложение , фиг. S22).

Онкогенные BRAF ^V600E и KRAS ^G12D приводят к снижению лабильных пулов Cu (I) за счет снижения уровней Gsr и увеличения экспрессии CCS.( A ) Репрезентативная ратиометрическая визуализация живых клеток FCP-1 на MEF, стабильно экспрессирующих ненаправленную контрольную кДНК ( Scr ), BRAF ^V600E кДНК или KRAS ^G12D кДНК. ( B ) Количественная оценка средней флуоресценции FCP-1 ( F _{зеленый} / F _{оранжевый} ) ± SEM для MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF ^V600E кДНК или KRAS ^G12D кДНК.Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим многократным сравнением Даннета. Данные взяты из анализа 105 или более отдельных ячеек. ( C ) Обнаружение иммуноблотом CCS или ACTIN в MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF ^V600E кДНК или KRAS ^G12D кДНК или Scr , обработанных 0,5 мМ BCS. Количественное определение: ΔCCS / ACTIN, нормализованное до Scr . Результаты из 3 независимых биологических повторов сравнивали с использованием непарного теста t .( D ) Количественная оценка средних уровней Cu (частей на миллион, ppm), обнаруженных с помощью ICP-MS для MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF ^V600E кДНК или KRAS ^G12D кДНК на массу образца ± SEM ( n = 5). Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим многократным сравнением Даннета. ( E и F ) Экспрессия qPCR мРНК Ctr1 или Atp7a из MEF, стабильно экспрессирующих кДНК Scr , BRAF ^V600E или KRAS ^G12D кДНК.( n = 4). Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим многократным сравнением Даннета. ( G и H ) Количественная оценка общего клеточного глутатиона (GSH, мкМ) или отношения GSH к GSSG (GSH / GSSG) ± SEM из MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF ^V600E кДНК , или KRAS ^G12D кДНК. Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета ( n ≥ 11).Данные взяты из 4 биологических повторностей, проведенных в трех повторностях. ( I и J ) Экспрессия qPCR мРНК Gclc или Gsr из MEF, стабильно экспрессирующих кДНК Scr , BRAF ^V600E или KRAS ^G12D кДНК. Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета ( n = 4). Данные взяты из 4 биологических повторностей, проведенных в трех повторностях.( K ) Обнаружение иммуноблотом GCLC, GSR или ACTIN в MEF, стабильно экспрессирующих кДНК Scr , BRAF ^V600E или KRAS ^G12D кДНК. Количественное определение: ΔGCLC / ACTIN или ΔGSR / ACTIN, нормализованные до Scr . Результаты из 3 независимых биологических повторов сравнивали с использованием непарного теста t . ( L ) Анализ проточной цитометрии уровня ROS, количественно выраженный средним значением интенсивности флуоресценции CellROX Green ± SEM для MEF, стабильно экспрессирующих Scr , BRAF ^V600E кДНК или KRAS ^G12D кДНК.Результаты сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета ( n ≥ 11). * P <0,05, ** P <0,01 и **** P <0,0001; нс, статистически не значимо. ( M ) Предполагаемые эффекты онкогенной активации BRAF ^V600E или KRAS ^G12D на биодоступность лабильных пулов Cu (I).

Учитывая наши коллективные результаты, которые показывают, что Cu (I) кажется менее биодоступным в контексте онкогенной трансформации, мы предположили, что различия в метаболизме глутатиона могут быть движущей силой фенотипа.С этой целью мы протестировали общие уровни GSH и отношения GSH / GSSG в MEF, трансформированных онкогенным BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , и обнаружили, что экспрессия любого из онкогенов увеличивает общие уровни GSH, хотя статистически значимо только в KRAS ^G12D. ячеек (рис.6 G ). К нашему удивлению, отношения GSH / GSSG были значительно ниже в BRAF ^V600E и KRAS ^G12D , стабильно экспрессирующих MEF, по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6 H ).Поскольку MEF, трансформированные BRAF ^V600E и KRAS ^G12D , фенокопировали генетический нокдаун Gsr в отношении пониженной ратиометрической флуоресценции от FCP-1 и уменьшенного отношения GSH / GSSG, уровни мРНК Gsr и экспрессия белка были допросили. При нормализации к контрольным клеткам уровни транскрипта Gsr были значительно снижены при стабильной экспрессии либо BRAF ^V600E , либо KRAS ^G12D , тогда как уровни транскрипта Gclc остались относительно неизменными среди них (рис.6 I и J ). Параллельно с уровнями транскрипта Gsr , экспрессия белка GSR снижалась в клетках BRAF ^V600E и KRAS ^G12D по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6 K ). Напротив, уровни белка GCLC были выше в клетках BRAF ^V600E и KRAS ^G12D по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6 K ). Чтобы еще больше подтвердить связь между онкогенезом, гомеостазом меди и изменениями экспрессии фермента метаболизма глутатиона, как BRAF ^V600E , так и KRAS ^G12D значительно увеличили уровни зеленой флуоресценции CellROX (рис.6 L ), предполагая, что онкогенная трансформация увеличивает АФК и, в свою очередь, снижает лабильный пул Cu (I). Из этих данных мы заключаем, что клетки, трансформированные BRAF ^V600E и KRAS ^G12D , обнаруживают лабильный дефицит Cu (I), частично из-за снижения уровней Gsr и повышенных уровней ROS, которые могут способствовать более окисленному клеточная среда из-за неспособности регенерировать GSH (рис. 6 M ).

Заключительные замечания

Сложное и динамическое взаимодействие между лабильными и общими пулами металлов имеет значение для гомеостаза металлов и нарушения регуляции металлов в здоровом и болезненном состояниях.Медь является ярким примером этой дихотомии сигнал / стресс, поскольку ее мощная окислительно-восстановительная активность делает ее важным питательным веществом, но такая же химическая реакционная способность делает потерю гомеостаза меди опасностью для окислительно-восстановительного баланса клетки. Чтобы удовлетворить потребность в новых химических инструментах для исследования лабильных пулов меди, которые будут использоваться в сочетании с дополнительными традиционными методами для определения общего состояния меди, мы разработали FCP-1, ратиометрический датчик FRET первого поколения, основанный на активности, который обеспечивает выборочную визуализацию лабильных Cu (I) объединяется в живых клетках с самокалибрующейся реакцией.FCP-1 использует классический мотив биоинорганического лиганда TPA для Cu (I) -зависимого расщепления, чтобы регулировать FRET между донорными единицами флуоресцеина и акцепторами родамина в зависимости от дозы, обеспечивая высокую специфичность к металлу и степени окисления для Cu (I). Благодаря своей логометрической реакции, FCP-1 способен визуализировать динамические изменения в уровнях лабильного Cu (I) в живых клетках с добавлением меди и / или хелатированием, а также отслеживать снижение уровня эндогенного лабильного Cu (I) в клетках с дефицитом MEF. в транспортере меди CTR1.Действительно, ратиометрическое считывание FCP-1 с внутренней самокалибровкой двух эмиссионных сигнатур является ключевым отличительным признаком для мониторинга базальных уровней лабильного Cu (I) в разных клеточных линиях, так как контрольный зонд FL-TPA, который использует тот же самый триггер на основе активности, но реагирует только в режиме интенсивности при 1 считывании выбросов, не может различить лабильный статус Cu (I) между линиями CTR1 дикого типа и нокаутными линиями CTR из-за вариабельности загрузки зонда.

На этом фоне мы применили FCP-1 для визуализации изменений в лабильных пулах Cu (I) в условиях окислительно-восстановительного стресса, уделяя особое внимание связи между гомеостазом меди и глутатиона.Действительно, мы наблюдали повышенные уровни лабильной Cu (I) в клетках с нокдауном Gclc , которые обладают меньшим количеством общего GSH по сравнению с соответствующими контролями дикого типа, тогда как мы обнаружили более низкие уровни лабильной Cu (I) в Gsr . нокдаун клеток относительно контрольных конгенеров. Эти данные визуализации отслеживают значительное снижение отношения GSH / GSSG в клетках с нокдауном Gsr , но не в клетках с нокдауном Gclc . Более того, мы идентифицировали снижение соотношения GSH / GSSG в MEF, трансформированных онкогенным BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , что, в свою очередь, вызывает лабильный дефицит Cu (I).В сочетании с тем фактом, что общие уровни меди остаются неизменными в нокдауне Gclc или Gsr и онкогенных клеточных линиях BRAF ^V600E или KRAS ^G12D , и что мы также наблюдаем более высокую экспрессию белка CCS, который может прочно связывать медь. и более низкие уровни лабильной Cu (I), ратиометрические измерения флуоресценции FCP-1 показывают, что на пул лабильных Cu (I) избирательно влияет трансформация онкогенов по всему пулу меди. Выявив связи между пулом лабильных Cu (I), метаболизмом глутатиона и онкогенными трансформациями, эта работа обеспечивает отправную точку для дальнейшего изучения того, как и почему снижение лабильных уровней Cu (I) может способствовать развитию и прогрессированию рака.