Лада х рэй характеристики: LADA XRAY Cross — Официальный сайт LADA

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в котором κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) вычисляется как:

ET = 1 — (τDA / τD)

, где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения для обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, Дж (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорно.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора посредством вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может находиться в диапазоне от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит к изменению рассчитанного расстояния только на 26 процентов, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для вариации κ в квадрате. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, а то и невозможно определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием методов резонансной спектроскопии переноса энергии и дифракции рентгеновских лучей в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предлагается теорией Ферстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Большая неопределенность существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной флуоресцентной поляризации донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близкими расстояниями донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ — в квадрате) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением: 2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) — угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A) — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение знания критического расстояния Фёрстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни распада флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии с помощью механизма Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрических форм и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (ов) визуализации, но практически любой прямой или инвертированный микроскоп можно дооснастить для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть объединены с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогеновой лампой на столбе для исследования и записи. ячейки, использующие стандартное светлое поле, фазово-контрастное или дифференциально-интерференционное ( DIC ) освещение.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа крепится стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье, обеспечивающая широкополосную флуоресценцию и получение изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального освещения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной приставки для сканирования в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

• Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
• Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
• Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительный срок службы, чтобы произошла резонансная передача энергии.
• Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
• При использовании методов маркировки антител биологическая активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами, не должна изменяться. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
• Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть присоединены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
• Живые клетки, помеченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставило значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух значений: I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между донорно-акцепторными парами и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным гашением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется стационарным, флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны в пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (а)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может происходить самотушение, что влияет на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные данные, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях метод фотообесцвечивания доноров менее сложен, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения донорной эмиссии измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод коррекции обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра эмиссии акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал эмиссии донора (нежелательные длины волн) проходит через эмиссионный фильтр.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением , которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение средней продолжительности жизни, когда они записываются как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донора и акцептора может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут иметь различное время жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресценции, классифицируются как во временной области ( в импульсном режиме , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется из фазового сдвига и глубины демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной областей для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенным применением флуоресцентного резонансного переноса энергии является измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки с помощью множества биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии — обзор

3.1.3.1.2 Флуоресцентная спектроскопия

Общие принципы объяснения флуоресцентной спектроскопии здесь не приводятся. Его можно найти в специальных учебниках [48], и его краткое изложение представлено на рис. 3.17.

Рисунок 3.17. Общий принцип флуоресцентной спектроскопии.(A) Представление основных переходов между двумя синглетными состояниями молекулы. На остальной части этого рисунка синяя и зеленая стрелки (темно-серая и серая стрелка в печатных версиях) представляют собой поглощение света и его излучение флуоресценцией соответственно. Оранжевая стрелка (светло-серая стрелка в версиях для печати) представляет релаксацию энергии за счет безызлучательных процессов. Для простоты теоретически запрещенный переход в более низкоэнергетическое триплетное состояние «T» не был представлен, но он лежит в основе излучения фосфоресценции.(B) Схематическое изображение флуоресцентного спектрофотометра. (C) Химическая структура и абсорбция (синяя кривая (темно-серая в печатных версиях)) — эмиссионные (зеленая кривая (серая в печатных версиях)) спектры флуоресцеина.

Наиболее распространенными флуоресцентными фрагментами являются органические флуорофоры (кумарины, флуоресцеины, родамины, оксазины и цианины в порядке увеличения длины волны флуоресцентного излучения), хелаты лантаноидов или флуоресцентные наночастицы (см. Главу 6.9).

Два наиболее интересных аспекта для целей этой книги состоят в измерении динамической релаксации светового излучения, позволяющем определять характерные времена жизни флуоресценции, и в определении расстояния между двумя флуорофорами (наложенными на одном или двух различных молекул), используя эффект резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

FRET обычно предназначен для определения расстояния (а также ориентации) между флуоресцентным донором ( D ) и акцептором ( A ). Эффективность безызлучательной передачи энергии между D и A зависит от следующего:

1.

Относительная ориентация D и A , которые рассматриваются как диполи

2.

Степень спектрального перекрытия между спектром излучения флуоресценции D и спектром поглощения A

3.

Расстояние r между D и A

Если спектральное перекрытие между флуоресценцией D и поглощением A равно нулю, передачи энергии не будет, даже если D и A очень близки. Если есть спектральное перекрытие, то передача энергии масштабируется как величина, обратная шестой степени r , что типично для диполь-дипольных взаимодействий между небольшими молекулами (см. Главу 2.1). Эффективность передачи энергии тогда определяется как

(3,34) E = R06R06 + r6

В этом уравнении R ₀ — это критическое расстояние, для которого эффективность передачи энергии снижается до 50% от максимальное значение при r = 0.

В теории Ферстера R ₀ пропорционально квантовому выходу донора ( ϕ ) и интегралу спектрального перекрытия J между излучением спектр D и спектр поглощения A :

(3.35) R0 = (8,8 × 10-25) · K2 · ϕ · Jn4

, где K учитывает взаимную ориентацию D и A . n — показатель преломления используемого растворителя.

Перед проведением экспериментов FRET с определенной молекулярной системой необходимы следующие предварительные эксперименты:

1.

Квантовый выход донора должен быть измерен в растворителе, используемом для экспериментов FRET.

2.

Спектры флуоресценции D и спектры поглощения A необходимо измерить при концентрациях, используемых в эксперименте FRET для вычисления интеграла перекрытия J .

Эффективность FRET показана на рис. 3.18 для различных значений R ₀ .

Рисунок 3.18. Эффективность передачи энергии резонанса флуоресценции как функция расстояния между D и A для R ₀ = 1 (), 2 ((серый в печатных версиях)) и 5 ​​((темно-серый в версии для печати)) нм.

На схемах в верхней части представлены изменения расстояния между D (обозначено звездочкой) и A (обозначено диском) по отношению к конформационному изменению.

Справедливость уравнения. (3.35) был критически протестирован для дансил- (Pro) _n -нафтилпептидов, проявляющих конформацию спирали полипролина II типа. Вдоль этой спирали расстояние между донором нафтила и акцептором дансила можно точно регулировать числом пролинов в аминокислотной последовательности [49].

FRET использовался для исследования многих механизмов реакции. Типичным примером является выяснение индуцированного вирусами слияния липидов, межфазного явления, имеющего фундаментальное значение в медицинских науках [50].

Флуоресцентная спектроскопия особенно полезна для исследования взаимодействий между биомакромолекулами, такими как белки, и их партнерами по связыванию. Действительно, взаимодействие может изменить локальную полярность вокруг флуорофора и, следовательно, локальные дипольные моменты. Это вызывает изменение положения либо самого низкого энергетического уровня (самая высокая занятая молекулярная орбиталь), либо / или энергетического уровня молекулярной орбитали возбужденного состояния (например, самая низкая незанятая молекулярная орбиталь) и, следовательно, изменение поглощения спектр, но еще более заметное изменение в спектре излучения.

В качестве примера рассмотрим собственные флуоресцентные аминокислоты в белках. Соответствующие флуоресцентные группы представляют собой боковые цепи триптофана (Trp в трехбуквенном коде аминокислот), тирозина (Tyr) и фенилаланина (phe). Среди этих боковых цепей Trp имеет самый высокий квантовый выход эмиссии. Максимум спектра поглощения расположен при 280 нм, а максимум излучения — при 340 нм в воде. Но этот максимум излучения смещается в сторону более коротких длин волн (синее смещение), если Trp находится в гидрофобной внутренней части белка, и смещается в сторону более высоких длин волн, когда белок разворачивается (см. Главу 2.9).

Интенсивность флуоресценции также можно изменить с помощью процессов гашения. График отношения интенсивности флуоресценции в отсутствие гасителя, F ₀ , к интенсивности флуоресценции F в присутствии концентрации гасителя [ Q ​​] обычно дает прямую линию:

(3,36 ) F0F = 1 + KS · [Q]

Наклон этого так называемого уравнения Штерна – Фольмера дает константу гашения K _S , которая напрямую связана со временем жизни флуоресцентной группы в отсутствие тушителя, τ , и бимолекулярной константе скорости процесса тушения, k _q , согласно

(3.37) Ks = kq · τ

Экспериментально полученное значение k _q часто сравнивают с константой скорости диффузии для бимолекулярного процесса k _d = 2,0 × 10 ¹⁰ L моль ^-1 с ^-1 . Когда k _q > k _d , процесс закалки ограничен диффузией, и процесс закалки является «статическим». Это означает, что существует комплексное образование между флуоресцентной молекулой в основном состоянии и гасителем.Процесс гашения также может быть «динамическим», подразумевая образование комплекса между флуоресцентной молекулой в возбужденном состоянии и гасителем.

Наконец, еще одно интересное применение флуоресцентной спектроскопии состоит в проведении анализов конкурентного связывания. Флуоресцентной молекуле (теперь называемой «рецептор» R ) сначала разрешается взаимодействовать с известной молекулой C ( C для «конкурента»), которая действует как гаситель и, как известно, связывается с известным область рецептора.Затем интересующий лиганд, L , титруют в рецепторном растворе; если интенсивность флуоресценции изменяется, C замещается L , что означает, что L связывается с рецептором в месте, близком к C . Хорошо известными примерами конкурентов флуоресценции альбуминов являются варфарин и ибупрофен, которые действуют как маркеры сайтов для сайта I (расположенного в субдомене IIA альбуминов) и сайта II (расположенного в субдомене IIIA альбуминов), соответственно [51].

Теперь мы сосредоточимся на реализации флуоресцентной спектроскопии на поверхностях.

Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу неупорядоченного белка.

Значение

Белки принимают неупорядоченные ансамбли до сворачивания, а иногда и как часть своей функции. Моделирование и исследования FRET часто описывают неупорядоченные конформации как более компактные, чем состояния случайных клубков, наблюдаемые при высоком денатуранте, тогда как малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) указывает, что эти конформации остаются расширенными.Устранение этого несоответствия улучшает наше понимание свойств белков, например, является ли вода достаточно плохим растворителем, чтобы вызвать неспецифический коллапс. Мы достигаем согласования, показывая, что добавление флуорофоров FRET уменьшает размеры неупорядоченного белка. Детальный анализ FRET и SAXS, наряду с учетом сокращения, индуцированного флуорофором, демонстрирует, что неупорядоченные и развернутые белки часто остаются сольватированными и расширенными без денатуранта, свойства, которые минимизируют неправильную укладку и агрегацию.

Abstract

Размеры, которые развернутые белки, включая внутренне неупорядоченные белки (IDP), принимают в отсутствие денатуранта, остаются спорными. Мы разработали процедуру анализа профилей малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и использовали ее, чтобы продемонстрировать, что даже относительно гидрофобные IDP остаются почти такими же расширенными в воде, как и при высоких концентрациях денатуранта. Напротив, как показано здесь, большинство измерений резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) показали, что относительно гидрофобные IDP значительно сокращаются в отсутствие денатуранта.Мы используем два независимых подхода для дальнейшего изучения этого противоречия. Во-первых, с помощью SAXS мы показываем, что флуорофоры, используемые в FRET, могут вносить вклад в наблюдаемое несоответствие. В частности, мы обнаружили, что добавление Alexa-488 к нормально расширенному IDP вызывает сокращение еще на 15%, что вполне соответствует сокращению, о котором сообщалось в исследованиях на основе FRET. Во-вторых, используя нашу процедуру моделирования и анализа для точного извлечения радиуса инерции (R _g ) и расстояния от конца до конца (R _ee ) из профилей SAXS, мы проверили недавнее предположение, что результаты FRET и SAXS могут быть согласованным, если R _g и R _ee «разъединены» (т.е.е., больше не просто пропорциональны), в отличие от случая гомополимеров случайного блуждания. Однако мы обнаружили, что даже для развернутых белков эти две меры измерений развернутого состояния остаются пропорциональными. Вместе эти результаты предполагают, что улучшенные процедуры анализа и коррекция значительных взаимодействий, управляемых флуорофором, достаточны для согласования предыдущих исследований SAXS и FRET, обеспечивая тем самым единую картину природы развернутых полипептидных цепей в отсутствие денатурирующего агента.

Белковые нарушения являются важным компонентом разнообразных клеточных процессов (1-4). В отличие от хорошо свернутых белков, которые населяют четко определенное функциональное состояние, развернутые и внутренне неупорядоченные белки (IDP) образуют широкий набор быстро взаимопревращающихся конформаций (3⇓⇓⇓⇓ – 8) с ошибками, которые плохо изучены и трудно измерить. . Особый интерес представляет степень, в которой ВПЛ заключают контракты в физиологических условиях (т. Е. В отсутствие денатурирующих агентов). Такое сокращение может иметь широкие последствия для нашего понимания сворачивания белков, взаимодействий и стабильности, а также действия денатурирующих веществ.Более того, понимание степени сжатия неупорядоченных ансамблей имеет глубокие последствия для разработки реалистичных симуляций складчатости и интерпретации малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и измерений FRET (9, 10).

Наше понимание физико-химических принципов, лежащих в основе того, будет ли полипептидная цепь складываться, принимать неупорядоченный, но, тем не менее, относительно компактный ансамбль или вести себя как расширенное, полностью сольватированное, самоизбегающее случайное блуждание (SARW), недостаточно для объяснения существующих данных.Большая часть этого понимания получена из исследований белков, разворачиваемых высокими концентрациями денатурирующих веществ, таких как мочевина и гидрохлорид гуанидина (Gdn). В этих условиях консенсус состоит в том, что белки ведут себя как SARW с показателем Флори (ν) 0,60 в соотношении R _g ∝ N ^ν (N = длина цепи). Напротив, нет единого мнения относительно поведения ВПЛ при более низком уровне денатуранта или его отсутствии. В частности, в то время как многочисленные FRET (11⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ – 25) и вычислительные исследования (11, 14, 18, 23, 26⇓⇓ – 29) утверждали, что расширенный неупорядоченный ансамбль обнаруживает при высоком уровне денатуранта сжимается значительно [обычно на 25-50% при переходе на низкий денатурант или без него (ν <0.5)] (11, 14, 18, 23, 26⇓ – 28, 30⇓⇓⇓⇓ – 35), аналогичное количество исследований SAXS сообщает о небольшом сокращении или его отсутствии в тех же условиях (10, 36–35). 41).

Разнообразные недавние исследования пытались примирить это несоответствие (Fig. 1 A ), которое имеет глубокие последствия для физики сворачивания белков. Применение более реалистичных симуляций и аналитических моделей привело к полученным FRET расстояниям, имеющим меньшую денатурантную зависимость (Рис. 1 A , Bottom ) (40, 42⇓ – 44).Параллельно улучшены данные и анализ SAXS, включая использование безразмерного графика Кратки, чтобы подчеркнуть изменения ν, а не R _г (что важно, поскольку добавление флуорофоров на концах цепи увеличит R _г из-за их массы), также предоставили доказательства незначительного сокращения ниже 2 M Gdn (Рис. 1 A , Bottom ) (45, 46). Тем не менее, значительные расхождения сохраняются в отсутствие денатуранта, даже когда для анализа одного и того же белка в идентичных условиях используются одни и те же подходы (рис.1, SI Приложение , рис. S1 и S2 и Movie S1). Недавние исследования предложили, что это несоответствие может быть устранено с помощью целостного анализа (42, 43), подчеркивая разделение между обычно фиксированной, пропорциональной зависимостью между R _g (определено из измерений SAXS) и R _ee (определено из Измерения FRET) без необходимости вызывать возмущение из-за присутствия флуорофоров (42).

Улучшенные процедуры анализа не устраняют расхождения между измерениями IDP, полученными с помощью SAXS и FRET.( A ) Данные R17 SAXS и FRET (из ссылки 43). ( A , Top ) Сравнение результатов, полученных при подборе данных FRET в предположении гауссовой цепи и данных SAXS с использованием приближения Гинье. ( A , Bottom ) Данные SAXS и FRET подходят с использованием нашего метода анализа MFF и аналогичного подхода (45). Черная линия лучше всего подходит гиперболической линии тренда; серые линии — 95% доверительные интервалы. ( B ) Профили SAXS для R17 ( Левый , данные из Ref.43) и N98 ( Правый , данные из ссылки 42), согласованные с MFF, значительно отличаются от ожидаемого поведения с использованием значений ν, взятых из аналогичного анализа данных FRET. Сплошные линии обозначают область, используемую в процедуре подгонки; пунктирные линии представляют экстраполяцию к более высоким значениям q. Хотя подходило ~ 500 точек на кривую рассеяния (серый цвет), большинство показанных данных были объединены только для целей презентации (черные точки). Повороты или перегибы данных при более высоких значениях qR _g , скорее всего, связаны с ошибками при вычитании буфера, что является более сложным при высоком q, низкой концентрации образца и / или пониженном контрасте рассеяния (например.g., при высоком денатуранте, см. Материалы и методы ). ( C ) Тенденции гидрофобности (Кайт-Дулиттл) в зависимости от ν в отсутствие денатуранта, полученного из SAXS, путем применения MFF к опубликованным данным, собранным из последовательностей складываемых белков (42, 45, 67⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓). № – 82). Также показаны результаты исследований FRET, рассчитанные как в исх. 20 для опубликованных данных (20, 42). Красная линия тренда для данных FRET из исх. 20. Черная линия тренда лучше всего соответствует показанным результатам SAXS. ( C , Top ) Гистограмма гидрофобности репрезентативных белков в PDB (набор данных из исх.45). ( D ) Кумулятивные распределения ν для репрезентативных белков из PDB, выведенные из линий тренда, показанных в C .

Чтобы всесторонне сравнить результаты исследований SAXS и FRET, мы собрали опубликованные наборы данных для различных ВПЛ (Рис. 1 C и D и SI Приложение , Таблица S3). При анализе с использованием нашего моделирования и молекулярного форм-фактора (MFF) исследования SAXS неизменно находят ν> 0,53 (среднее значение = 0,55), тогда как ν, полученное из исследований FRET, обычно падает ниже 0.50 (среднее значение = 0,46). Это расхождение 0,09 является существенным по отношению ко всему диапазону ν, который варьируется только от 0,6 (для SARW) до 0,5 (где внутрицепочечные взаимодействия одинаково благоприятны для взаимодействий растворитель-цепь) до 0,33 (для уплотнения в сферу; это несколько выше для несферических компактных состояний). В целом, результаты SAXS предполагают, что конформационные ансамбли большинства развернутых белков и IDP с белковоподобным составом последовательностей сильно расширены (ν> 0.5) и вода является хорошим растворителем, тогда как FRET предполагает иное (рис. 1 D ).

Приведенные выше и другие результаты привели нас и других к поиску факторов, которые могут способствовать стойкому несоответствию между представлениями измерений IDP на основе SAXS и FRET (9, 29, 39, 42, 43, 47⇓⇓ – 50 ). Одна альтернатива, обозначенная здесь «гипотеза разделения гетерополимера», утверждает, что гетерополимерная природа белков приводит к изменению взаимосвязи между R _g и R _ee , взаимосвязь, которая является фиксированной (т.е.е., независимо от длины цепи) в соотношении 6,3 для гомополимера SARW. Недавнее моделирование показывает, что это соотношение не может быть зафиксировано для развернутых белков, которые более сложны, чем гомополимеры (29, 39, 42, 43). Эта «развязка» предлагает возможное объяснение несоответствия между SAXS (который чувствителен к R _g ) и FRET (который чувствителен к R _ee ). Напротив, вторая гипотеза, обозначенная здесь «гипотеза взаимодействия флуорофоров», предполагает, что в отсутствие денатуранта флуорофоры FRET взаимодействуют друг с другом и / или с полипептидной цепью, вызывая конформационный ансамбль конструкций, модифицированных флуорофором, к сокращаются больше, чем в отсутствие этих флуорофоров (9, 45, 47, 50, 51).

Здесь мы обращаемся как к гипотезе разделения, так и к гипотезе взаимодействия флуорофора. Мы использовали SAXS, чтобы охарактеризовать радиус вращения IDP до и после добавления обычно используемого флуорофора. Мы обнаружили, что такая модификация флуорофора изменяет конформационный ансамбль в отсутствие денатуранта, уменьшая его размеры, измеренные методом SAXS, на 10–20%. В сочетании с улучшенными процедурами анализа с использованием реалистичных смоделированных ансамблей как для SAXS, так и для FRET, этого индуцированного флуорофором коллапса достаточно для согласования результатов исследований SAXS и FRET.Параллельно с этим мы представляем измерения SAXS на полиэтиленгликоле (PEG), подтверждающие предыдущие сообщения о том, что добавление флуорофоров также вызывает сжатие этого полимера SARW (9), открытие, которое недавно было подвергнуто сомнению (42). Более того, мы показываем, что SAXS может извлекать R _g , ν и R _ee с точностью выше 97% при анализе с использованием нового MFF, разработанного для гетерополимеров. Эти симуляции достаточно точны для воспроизведения данных рассеяния без необходимости выбора только подансамбля конформаций, как это обычно используется в других процедурах подбора данных.Наконец, мы демонстрируем степень, в которой можно использовать небольшие отклонения от идеальности в данных SAXS, чтобы сделать вывод о смещениях внутри гетерополимерного конформационного ансамбля.

Результаты

Маркировка флуорофора вызывает коллапс.

Чтобы напрямую проверить гипотезу взаимодействия флуорофора, мы измерили профили SAXS немодифицированного IDP и того же самого IDP, сайт-специфически модифицированного одной или двумя копиями обычно используемого флуорофора FRET Alexa-488. Мы выбрали этот флуорофор, потому что он относительно небольшой и гидрофильный, что снижает вероятность образования взаимодействий, которые могут изменить развернутый ансамбль, по сравнению с большинством других флуорофоров FRET (43).В качестве тестового белка мы использовали PNt, IDP с хорошим поведением, содержащий 334 аминоконцевых остатка пертактина (52). Для получения PNt, модифицированного моно- и двойным флуорофором, мы использовали тиол-реактивный Alexa-488 для модификации остатков цистеина либо в положении 117 (PNtC-Alexa488), либо в положениях 29 и 117 (PNtCC-Alexa488). В качестве контроля мы использовали немодифицированный родительский белок (PNt) и алкилирование для получения конструкций без флуорофоров (PNtC-Alkd и PNtCC-Alkd).

Добавление Alexa-488 снижает измеренные методом SAXS размеры PNt как в отсутствие Gdm, так и при промежуточных концентрациях (рис.2 A и SI Приложение , Таблица S1). В частности, при переходе от 4 к 0 M Gdn, R _{, g} и ν уменьшаются почти в два раза для модифицированного флуорофором PNtCC-Alexa488, чем для PNtCC-Alkd или PNt (рис. 2 B и SI Приложение ). , Таблица S1). Эти данные указывают на то, что присутствие Alexa-488 приводит к сокращению конформационного ансамбля PNt. Следует отметить, что в то время как 2 M Gdn является хорошим растворителем (ν> 0,50) для немеченого белка, мечение флуорофором приводит к измеримым внутримолекулярным взаимодействиям даже при этой относительно высокой концентрации денатуранта (рис.2 B , Правый ). В соответствии с общим происхождением эффекта, величина этого зависящего от денатуранта расширения качественно аналогична наблюдаемой FRET для множества других белков (рис. 1 B ) (42, 43). Мы также наблюдали зависимое от флуорофора снижение среднего R _g и ν для однонитевой конструкции PNtC-Alexa488 (рис. 2), что указывает на то, что, помимо предполагаемых взаимодействий флуорофор-флуорофор, взаимодействия флуорофор-белок также вносят вклад в наблюдаемое сокращение.

Добавление Alexa-488 изменяет рассеяние PNt. ( A ) Безразмерные графики Кратки для PNt дикого типа (серый), PNtCC-алкилированного (черный), PNtC-Alexa488 (одиночная метка, синий) и PNtCC-Alexa488 (двойная метка, красный) в 0,15 M KCl, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Планки погрешностей представляют собой распространенную ошибку из SD, рассчитанного с учетом статистики подсчета (Пуассона), где σ = √counts. Данные были подогнаны и отображены в соответствии с процедурой, описанной на рис. 1 (см. Также Материалы и методы ).Результаты для алкилированного PNt неотличимы от PNt дикого типа, но существуют значительные различия для PNt, меченного флуорофором Alexa-488. ( B ) R _g и ν как функция концентрации Gdn. Данные серых кривых из исх. 45.

Следует отметить, что это сокращение происходит, несмотря на установившиеся значения анизотропии флуоресценции для PNtCC-Alexa488, равные 0,11 и 0,08 в 0 и 2 М денатуранте, соответственно ( SI Приложение , Таблица S2), ниже порогового значения, которое обычно рассматривается как доказательство. свободного вращения прикрепленных к белкам флуорофоров (42, 53).Из этих результатов мы заключаем, что добавление даже одного из более мелких, более гидрофильных флуорофоров, обычно используемых для измерений FRET, может значительно уменьшить размеры неупорядоченной полипептидной цепи (42, 43, 53), наблюдение, которое помогает согласовать SAXS – FRET несоответствие.

Размеры ПЭГ, полученные методом SAXS, не зависят от концентрации полимера.

В более раннем исследовании мы сообщили, что добавление Alexa-488/594 к PEG приводило к денатурант-зависимому изменению FRET (9), аналогичному тому, которое наблюдается в развернутых белках.Однако сжатия не наблюдалось, когда эквивалентный немеченый полимер исследовали с помощью малоуглового рассеяния нейтронов. Было высказано предположение, что высокие (3 мМ) концентрации ПЭГ, использованные в этом исследовании рассеяния, маскируют то, что в противном случае было бы зависимым от денатуранта изменением в R _g (42). Чтобы проверить это, мы измерили профили SAXS в диапазоне концентраций ПЭГ и денатуранта и не обнаружили никаких доказательств значительного изменения размеров этого высокогидрофильного полимера (рис.3). Аналогичным образом, во всех условиях мы наблюдали показатель Флори, равный 0,60, что дополнительно подтверждает, что ПЭГ ведет себя как SARW независимо от концентрации денатуранта. Эффекты флуорофора, а не сокращение цепи, таким образом, остаются простейшей интерпретацией денатурант-зависимых изменений FRET, ранее наблюдавшихся для меченных флуорофором вариантов этого полимера (9).

SAXS ПЭГ не зависят от денатуранта. ( A ) Безразмерные графики Кратки для ПЭГ 24 кДа при 0.5 мМ и 0,05 мМ в 0,15 M KCl, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Нормализованный профиль рассеяния PEG 24 кДа не изменяется от 0 до 4 M Gdn в широком диапазоне концентраций PEG. Для ясности профили рассеяния смещены по вертикали. Данные были подогнаны и отображены с использованием процедуры, описанной на фиг. 1. ( B ) R _g и ν как функции концентрации Gdn для 0,5 мМ и 0,05 мМ PEG. Открытые и закрытые точки смещены по горизонтали для ясности.

Проверка гипотезы о разделении гетерополимеров.

Взятые вместе, вышеупомянутые наблюдения показывают, что флуорофоры, добавленные к IDP, приводят к значительному сокращению, что способствует различным выводам, сделанным из предыдущих исследований SAXS и FRET. Эти наблюдения, однако, не исключают возможность того, что, как утверждалось ранее (42), развязка гетерополимера (т. Е. Связь между R _ee и R _g , отклоняющаяся от фиксированной пропорциональности, наблюдаемой для гомополимеров) также может вносить свой вклад. к расхождению SAXS – FRET.

Чтобы исследовать, приводит ли конформационный ансамбль реалистичного гетерополимера к значительной непропорциональности между R _ee и R _g , мы использовали Upside, наши модели Cβ-уровня (54, 55), чтобы смоделировать рассеяние для развернутых ансамблей. 50 белков из 250–650 остатков, случайно выбранных из банка данных по белкам (PDB). В своей простейшей версии Upside представляет собой каркас полипептида с шестью атомами на остаток (N, Cα, C, H, O и Cβ) и использует зависимые от соседей карты Рамачандрана, полученные из библиотеки катушек (56).Такие модели способны воспроизводить R _g и NH остаточные диполярные связи (RDC), наблюдаемые в развернутых белках; эти два параметра чувствительны к глобальным и локальным свойствам магистрали соответственно (57, 58). Для создания ансамблей гетерополимеров мы отнесли каждый Cβ как гидрофобный, так и полярный (H / P). Благоприятные профили взаимодействия (форма, показанная в ссылке 45, SI, приложение , рис. S3 A ) вводятся только между атомами Cβ гидрофобных остатков, а самопереключение накладывается на все атомы.Для каждой из 50 последовательностей мы использовали 30 различных сил взаимодействия Cβ. После создания этих 1500 ансамблей H / P конформаций скелета мы добавили явные боковые цепи (59), а затем рассчитали профили рассеяния гидратированных версий белков (60).

Для этих 1500 ансамблей мы сравнили истинные значения R _g , ν и R _ee , рассчитанные непосредственно из атомных координат, со значениями, полученными путем аппроксимации имитационного рассеяния (с добавлением реалистичных случайных ошибок) с использованием нашего оригинального MFF, разработанного для гомополимеров (45).Как и в случае гомополимеров, мы находим, что значения R _ee и R _g , наблюдаемые в этих симуляциях, пропорциональны (т. Е. Остаются связанными) с коэффициентом корреляции R ² = 0,99 (рис. 4 А ). Затем мы аппроксимируем смоделированные профили рассеяния, чтобы определить: R _g ^{соответствует} , ν ^{соответствует} и R _ee ^{соответствует} , причем последнее получено с использованием соотношения (R _ee / R _g ) 2 = G (ν), где G (ν) была откалибрована с использованием нашего исходного моделирования гомополимеров ( SI Приложение , рис.S1 D ). Мы обнаружили среднее абсолютное отклонение всего 1,3 Å, 0,011 и 4,2 Å соответственно, что представляет собой среднюю абсолютную ошибку 3%, 2% и 4% для R _g , ν и R _ee ( SI Приложение , рис. S3). Наибольшие отклонения наблюдаются для более компактных конструкций; для более протяженных конформаций (ν> 0,54) ошибка составляет ∼2%. Корреляция R _g ^{соответствует} и R _ee ^{соответствует} осталась высокой, R ² > 0.99.

обнаруживает сильную связь между R _g и R _ee , а профили SAXS являются надежным показателем R _g , ν и R _ee , а также дают информацию о степени неоднородности. ( A ) Связывание между R _g и R _ee , полученное из смоделированных ансамблей с использованием модели H / P (черный) или нашего потенциала, используемого для сворачивания белков (красный). ( B — D ) Сравнение R _g , ν и R _ee , рассчитанных на основе координат смоделированных ансамблей, по сравнению со значениями, полученными при подгонке с нашим MFF _het (R _g , ν) с SAXS профили ансамблей со случайно добавленными экспериментальными ошибками.( E ) Отклонения в ν _концов наблюдаются для гетерополимеров с менее хорошо перемешанными паттернами H / P (полученными путем аппроксимации наклона зависимости внутрицепочечного расстояния R _{| i — j |} от разделение последовательностей, | i — j |, где | i — j |> N / 2). ( F ) Эффекты Δν _end при различных значениях ν. ( G ) Подбор экспериментальных данных для MFF (R _g , ν, Δν _конец ) демонстрирует, что мечение флуорофора и образование петли через дисульфидные связи в PNt вызывает значительные и измеримые отклонения.

Чтобы еще больше уменьшить небольшую ошибку, связанную с применением нашего MFF, полученного из гомополимеров, к рассеянию гетерополимеров, мы создали новый молекулярный форм-фактор, MFF _het , используя моделирование H / P, описанное выше, и ту же общую процедуру. как описано в исх. 45. Применение этого слегка модифицированного MFF _het снижает ошибки в подогнанных R _g , ν и R _ee до 0,5, 0,005 и 2,7 Å, соответственно, что составляет 1%, 1% и 2% среднего значения. абсолютная погрешность (рис.4 B — D ). Эти результаты демонстрируют, что наша процедура анализа на основе MFF возвращает точные значения для R _g и R _ee , которые остаются пропорциональными (т. Е. Связанными) даже для гетерополимеров.

Далее мы рассмотрели вопрос о том, чувствительны ли наши выводы к деталям нашей модели или энергетической функции. Чтобы проверить это, мы провели дополнительное моделирование с использованием более подробной версии алгоритма Upside, который способен сворачивать de novo белки с <100 остатками (54, 55).В этой версии каждая из 20 боковых цепей представлена ​​многопозиционным эксцентриковым валиком, который позволяет детально упаковать сердечник. Энергетическая функция включает водородные связи, взаимодействия боковая цепь-боковая цепь и боковая цепь-основная цепь, аминокислотно-зависимые потенциалы двугранного угла и член десольватации. Используя эту модель, мы сгенерировали 30 ансамблей для каждого из шести белков (PNt и пять других белков, случайно выбранных из 50, описанных выше), используя короткие симуляции, которые выбирают только развернутое состояние.Мы получили ансамбли, выполнив моделирование обмена репликами в диапазоне температур от 280 до 320 К, как описано ранее (54, 55). Значения ν, полученные из этих ансамблей, находились в диапазоне от 0,4 до 0,6 в зависимости от температуры моделирования. Примечательно, что значения R _ee , R _g и ν, полученные непосредственно из этих более реалистичных ансамблей, находятся в хорошем согласии со значениями, определенными после подгонки с нашим MFF _het , с почти такой же точностью, что и для более простого H / P-ансамбли (рис.4 A — C , красные точки). Кроме того, непосредственно вычисленные значения для R _g и R _ee для ансамблей остаются пропорциональными с коэффициентом корреляции R ² = 0,99. Следовательно, наш вывод, что R _g и R _ee остаются связанными даже для гетерополимеров, устойчив к деталям нашего моделирования.

Измерение отклонений от идеальности в гетерополимерах.

MFF _het точно отражает общие размеры неупорядоченных гетерополимеров для белковоподобных последовательностей H / P и может использоваться в большинстве случаев.Тем не менее, небольшие, но измеримые отклонения наблюдаются для белков в нашем тестовом наборе с менее хорошо смешанными паттернами H / P ( SI Приложение , рис. S4). Эти различия можно увидеть на графике распределения внутримолекулярных расстояний, где наклон на расстояниях разделения | i — j | > N / 2 может отличаться от среднего наклона, который определяет глобальное значение ν (рис. 4 D ). Определим изменение наклона как Δν _конец (рис. 4 D ). Отрицательные значения Δν _конец коррелируют с преобладанием гидрофобных остатков на концах полипептидной последовательности (рис.4 D и SI Приложение , Рис. S4 C ) и с отклонениями в G (ν) ( SI Приложение , Рис. S4 A ) ( R ² ∼ 0.84). Профиль SAXS наиболее чувствителен к Δν _end при низком qR _g (рис. 4 E ).

Для количественной оценки неидеальности гетерополимеров на основе данных SAXS мы сгенерировали более общий трехпараметрический форм-фактор, MFF _general (R _g , ν, Δν _end ) (рис.4 E и F и фильм S2). Чтобы продемонстрировать его способность давать полезную информацию, мы подобрали данные из PNt, PNtCC-Alexa488 и циркулярного (с дисульфидными связями) PNtCC при 2 M Gdn (рис. 4 F ). Δν _конец снижается с ∼0 для PNt до приблизительно -0,1 для PNtCC-Alexa488 и приблизительно до -0,2 для кольцевых PNtCC, что согласуется с увеличением взаимодействий на аминоконце цепи. Менее резкие возмущения, такие как менее хорошо смешанные паттерны H / P и более короткие аминокислотные последовательности с более низким полезным диапазоном qR _g , могут потребовать более высокого отношения сигнал / шум для измерения Δν _end .Тем не менее, эти данные демонстрируют потенциал SAXS для выявления для неупорядоченных полимеров зависимых от последовательности отклонений от поведения гомополимера (рис. 4 E и F ), при этом все еще точно измеряя R _g и ν (рис. 4 А — С ).

В пределе бесконечной длины цепи масштабный показатель Флори ν имеет значения 0,33, 0,50 и 0,60, соответствующие глобулам, случайным блужданиям и SARW, соответственно. Тем не менее, мы и другие придерживаемся прагматического подхода и позволяем ν принимать промежуточные значения; е.g., как получено из наклона графиков масштабирования R _g в зависимости от длины цепи или R _ij в зависимости от | i — j | ( SI Приложение , рис. S6). В поддержку этого подхода можно наблюдать при увеличении силы внутрицепочечного взаимодействия уменьшение как I (q) при высоком q, так и наклона графиков масштабирования для белков из 100-1000 остатков (Fig. 4). Соответственно, мы считаем, что использование значений ν, выходящих за рамки трех канонических значений, обеспечивает законный и практичный подход для сравнения качества растворителей для систем разного размера и классификации, является ли вода хорошим или плохим растворителем для полимеров конечной длины.

Обсуждение

В то время как измерения SAXS указывают на то, что вода является хорошим растворителем (ν> 0,5) для развернутых полипептидов, исследования на основе FRET обычно сообщают об обратном (ν <0,5). Однако мы обнаруживаем, что сочетание улучшенных процедур анализа и более тщательного рассмотрения взаимодействий флуорофор-флуорофор и / или флуорофор-цепь достаточно для объяснения этого несоответствия. Эти находки приводят к единой картине, в которой развернутое состояние белков представляет собой SARW при высоком денатуранте и сжимается лишь незначительно (намного меньше, чем ранее сообщалось в литературе FRET) в отсутствие денатуранта.В частности, мы обнаружили, что мечение с помощью Alexa-488, обычно используемого флуорофора FRET, может изменить конформационный ансамбль IDP, уменьшая R _g и ν, даже когда анизотропия флуоресценции низкая, относительно принятых пределов для свободного вращения флуорофора ( 42, 53). В сочетании с предыдущими исследованиями (9) аналогичные выводы можно сделать для PEG, известного SARW. Эти результаты, наряду с нашим предыдущим результатом о том, что неупорядоченные цепи претерпевают умеренное расширение денатуранта (45), и улучшенными методами извлечения значений R _g из данных FRET (40, 42–44), теперь обеспечивают достаточную основу для устранения несоответствий между SAXS и FRET по размерам неупорядоченных белков.Фундаментальный и важный вывод полученной единой картины состоит в том, что даже в отсутствие денатурирующего агента вода остается хорошим растворителем для большинства развернутых белков.

Наши данные об эффектах, индуцированных флуорофором, согласуются с предыдущими выводами о том, что молекулярные размеры, выведенные из FRET, могут зависеть от используемой пары флуорофоров, при этом более гидрофобные флуорофоры приводят к большему сокращению (43). МД-моделирование с парой флуорофоров Alexa-488/594, например, привело к 10% сокращению IDP даже в 1 М мочевины (61).Аналогичным образом, недавнее исследование показало, что сигналы одномолекулярного FRET (smFRET) как от ДНК, так и от PEG зависят от условий растворителя, при которых размеры цепей, как ожидается, будут инвариантными (51). Однако, явно не согласившись с нашими данными, Fuertes et al. (42) провели измерения SAXS на пяти IDP с и без Alexa-488/594 и пришли к выводу, что в среднем изменения, наблюдаемые при добавлении флуорофоров, были минимальными. Однако при рассмотрении каждого белка в отдельности различия кажутся значительными по сравнению с узким диапазоном возможных значений.В частности, для пяти белков, охарактеризованных в этом исследовании, ν _{без метки} — ν _метка = 0,08, 0,03, 0,03, -0,02 и -0,04 (или 0,09, 0,06, 0,03, -0,02 и -0,08 при анализе с использованием наши процедуры; SI Приложение , рис. S5). Хотя Fuertes et al. (49) утверждают, что только один белок (NLS) демонстрирует индуцированное флуорофором сокращение, на самом деле четыре из пяти протестированных белков имели статистически значимые индуцированные флуорофором изменения в ν, причем более половины из них демонстрировали сокращение, индуцированное флуорофором (42). величины, аналогичной сокращению, которое мы наблюдали для меченного флуорофором PNt в воде (45) ( SI Приложение , рис.S5). Вместе эти данные подтверждают последовательную картину возмущений, вызванных флуорофором, которые вносят свой вклад в различия в величине и денатурирующей зависимости R _g , полученные с помощью SAXS и FRET.

Другой фактор, который, как предполагалось, способствовал расхождению между результатами SAXS и FRET, — это отклонения от пропорционального отношения между R _g и R _ee , которое может возникнуть при анализе гетерополимеров по сравнению с гомополимерами (42). В основе этой точки зрения лежит наблюдение, что если переоценить ансамбль (т.е., вычисляет R _g с использованием только подмножества конформаций), многие возможные значения R _ee согласуются с любым заданным R _g (и наоборот). Вместо того, чтобы выбирать подансамбль конформаций для соответствия паре параметров, мы выбрали альтернативный подход (45). С самого начала мы создаем физически правдоподобные ансамбли, создаем MFF, используя все эти ансамбли, и проверяем, соответствует ли он данным в целом. Мы обнаружили, что наша MFF точно соответствует всему профилю рассеяния (а не только R _g ), что обеспечивает надежную поддержку нашей процедуры.Поскольку мы можем вычислить значения R _g и R _ee непосредственно из базовых ансамблей, у нас есть процедура для получения этих двух параметров путем подгонки данных SAXS с нашим MFF. Мы обнаружили, что для реалистичных денатурированных ансамблей складываемых последовательностей моделируемые пары R _g и R _ee , а также их аналоги, определенные из профилей рассеяния, пропорциональны ( R ² > 0,99). Это оставляет красители как источник остающегося несоответствия между SAXS и FRET.

Используемый нами MFF несовершенен в том смысле, что несколько разные ансамбли могут быть подобраны с использованием одних и тех же параметров R _g и ν. Но для этих двух параметров ошибка очень мала по сравнению с их истинными значениями (рис. 4 A — C ). Учет эффектов гетерополимера не меняет этого вывода. Из этих результатов мы заключаем, что SAXS хорошо подходит для экстракции как R _g , так и R _ee для неупорядоченных гетерополимеров, избегая при этом потенциальных артефактов из-за взаимодействий флуорофора с полипептидными цепями.Этот вывод не отрицает возможности FRET для измерения динамики, связывания и конформационных изменений; Однако в нем подчеркивается, что следует проявлять осторожность при использовании FRET для определения количественных расстояний в исходной немеченой биомолекуле.

Почти дюжина наборов данных IDP SAXS, представленных здесь и ранее (45), как было показано, хорошо подходят для нашего общего MFF ( SI Приложение , таблицы S1 и S3). Это открытие предполагает, что взаимодействия, приводящие к сокращению цепи, распространяются по белковым последовательностям.Водорастворимые, хорошо уложенные белковые последовательности обычно представляют собой хорошо перемешанные гетерополимеры с относительно небольшими участками последовательных гидрофобных остатков (62). Эти хорошо перемешанные последовательности имеют тенденцию вести себя как гомополимеры при измерении глобальными методами с низким разрешением, такими как SAXS. Действительно, мы продемонстрировали, что при достаточном качестве данных плохо смешанные последовательности можно идентифицировать по их отклонению от нашего MFF (рис. 4 D — F ). Большие отклонения могут возникать у некоторых IDP, особенно с частичным сворачиванием, необычным формированием паттерна последовательности (например.g., блок-сополимеры) и / или в условиях тесноты, которые могут выполнять определенные функции (63, 64).

Унифицированная картина, представленная здесь относительно исследований SAXS и FRET развернутого состояния в отсутствие денатуранта, усиливает мнение о том, что вода является хорошим растворителем для большинства развернутых полипептидов, свойство, которое должно уменьшать неправильную укладку и агрегацию, одновременно облегчая синтез и транспорт. То, что большинство белков, тем не менее, легко сворачивается в воде, предполагает, что взаимодействия, управляющие сворачиванием, являются более стабилизирующими, т.е.е. преодолеть способность воды сольватировать развернутое состояние — чем те, которые способствуют неспецифическому коллапсу. Действительно, наблюдение, что, несмотря на минимальные доказательства значительного сокращения развернутого состояния даже при полном отсутствии денатуранта, некоторые белки остаются стабильно свернутыми до 6 M Gdn (41, 65), предполагает, что нативные взаимодействия гораздо более благоприятны, чем любые другие. неспецифические взаимодействия, связанные с коллапсом. Однако, учитывая высокоспецифический характер взаимодействий, образующихся в нативных белках, их способность преодолевать сольватацию развернутой цепи, возможно, не удивительна.

Материалы и методы

PNtCC и PNtC были экспрессированы в Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS и очищены от телец включения, как описано ранее (45, 52, 66), со следующими модификациями. После солюбилизации телец включения конструкции PNt повторно укладывали в 50 мМ Tris pH 7,2 с 50 мМ β-меркаптоэтанола (βME). Перед заключительной стадией эксклюзионной хроматографии к исходному белковому раствору добавляли 20 мМ βМЕ.

Дополнительную информацию об алкилировании белков и маркировке Alexa-488, а также об измерениях стационарной анизотропии, анализе данных SAXS и моделировании можно найти в приложении SI .

Примечание добавлено в доказательство.

Во время обзора было опубликовано исследование, в котором флуорофоры участвовали в усилении аффинности связывания между двумя IDP (83).

Благодарности

Мы благодарим Шриниваса Чакраварти и М. Чемпиона за их помощь в области SAXS и масс-спектрометрии, соответственно; и О. Бильзель, Х. С. Чан, С. Такахаши, Р. Бест, Р. Паппу, Д. Тирумалай, Ю. Бай, А. Холхаус, Э. Мартин и Б. Шулер за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантом NIH GM055694 (Т.R.S.) и GM130122 (для T.R.S. и P.L.C.), Фонд W. M. Keck Foundation (P.L.C.) и Национальный научный фонд гранты GRF DGE-1144082 (для J.A.R.) и MCB 1516959 (для C.R. Matthews, который финансировал периодические встречи между нашими лабораториями). Использование Усовершенствованного источника фотонов, пользовательского объекта Управления науки, находящегося в ведении Управления науки Министерства энергетики (DOE) Аргоннской национальной лабораторией, поддерживалось Министерством энергетики в рамках контракта DEAC02-06Ch21357. Этот проект поддержали NIH 2P41RR008630-18 и 9 P41 GM103622-18.

Сноски

• Вклад авторов: J.A.R., M.A.B., K.W.P., P.L.C. и T.R.S. спланированное исследование; J.A.R., M.A.B., A.M.Z., P.L.C. и T.R.S. проведенное исследование; J.A.R., M.A.B., P.L.C. и T.R.S. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; J.A.R., M.A.B., P.L.C. и T.R.S. проанализированные данные; и J.A.R., M.A.B., K.W.P., P.L.C. и T.R.S. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1813038116/-/DCSupplemental.

Разработка репортеров темного хромопротеина для фотоакустической микроскопии и визуализации FRET

Общие методы

Все синтетические ДНК-олигонуклеотиды, используемые для клонирования, и библиотеки были приобретены у Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Плазмидная ДНК Miniprep, полимеразные цепные реакции (ПЦР), расщепление рестрикционными ферментами, лигирование и электрофорез в агарозном геле проводили согласно Sambrook et al. ⁴¹ ДНК-полимераза Pfu была получена из Fermentas, используемого для регулярной ПЦР, а набор QuikChange Multi был приобретен у Agilent Technologies и использовался для сайт-направленного мутагенеза. Все рестрикционные ферменты были получены от Fermentas или New England Biolabs. ДНК-лигаза Т4 была получена от Life Technologies. Продукты ПЦР и расщепления очищали с помощью набора для быстрой экстракции из геля QIA (QIAGEN, Валенсия, Калифорния) или набора для экстракции из геля GeneJET (Fermentas) в соответствии с инструкциями производителя.Все секвенирование проводилось в отделе молекулярной биологии Университета Альберты или в основных службах ДНК Университета Калгари. Все фильтры для флуоресцентной визуализации были приобретены у Chroma Technology (Рокингем, Вирджиния), Omega Filters (Браттлборо, Вирджиния) или Semrock (Рочестер, штат Нью-Йорк).

Очищенный белок и